[发明专利]基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法

说明书

本发明公开了一种基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法，该方法以粒径均匀的微球为载体，在微球表面合理固定特定核酸探针，通过控制条件，一个微球表面的核酸探针能特异性地和单个靶标核酸标志物分子结合，然后通过合理设计核酸扩增方法，使得该单分子引发的微球表面的信号扩增和荧光信号富集足够点亮该单个微球。而没有结合目标核酸标志物分子的微球，无法引发核酸扩增和荧光信号富集，呈现出阴性荧光信号。利用临床和普通实验室广泛配置的流式细胞仪即可区分出有荧光信号(阳性)和无荧光信号(阴性)微球的个数。因此，通过计数阳性微球的个数，可实现核酸标志物的数字式绝对定量分析。

技术领域

本发明属于核酸标志物检测技术领域，具体涉及一种以粒径均匀的微球作为载体构建单分子核酸扩增体系，以应用广泛的常规流式细胞仪作为单颗粒计数手段，从而实现核酸标志物数字式绝对定量分析。

背景技术

遗传信息从基因组DNA转录为信使RNA(mRNA)，再由mRNA翻译为蛋白质，是基本的生命进程。在这一系列过程中，基因突变、DNA表观遗传学修饰、mRNA以及microRNA表达含量的失常均可能导致癌症的发生。因此，实现相关核酸标志物的高灵敏度准确分析对生命进程以及癌症诊断具有重要的意义。

目前针对核酸标志物的高灵敏度分析，主要通过结合核酸扩增机制和实时荧光分析技术，其中实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是应用最广泛的核酸标志物定量分析技术。然而，RT-qPCR技术是一种相对定量的分析方法，定量一般需依赖通过C_t值和已知拷贝数的标准品绘制的标准曲线。但是对于很多基因组DNA、mRNA，很难找到与待测物长度、结构完全一致的标准品(或稳定的内参)，同时，C_t值的准确性也受反应条件等因素的影响，易导致定量结果出现偏差。针对相对定量分析方法存在的问题，近年来兴起了一批数字式绝对定量分析方法。其中已商品化的微滴数字PCR(ddPCR)已经广泛应用于低拷贝数核酸标志物的绝对定量分析。ddPCR方法以一个微乳为反应单元，通过极度稀释理论使得一个微乳中最多包含有一个待测核酸标志物分子，然后单个微乳中单个核酸标志物分子引起的PCR扩增使得该微乳呈现阳性的荧光信号，通过计数阳性微乳的个数实现待测核酸标志物的绝对定量分析。该方法具有更高的准确度和灵敏度。然而，商品化的ddPCR仪器都很昂贵，微乳液滴的生成试剂都是各仪器公司的专利产品，一旦改变反应介质很容易破乳，所以较难方便地扩展应用于一些更高效的核酸扩增技术中。其次，ddPCR技术需要较为繁琐的微乳形成和液滴转移过程，在此过程中样品很容易受到影响。

因此，考虑到核酸标志物检测对于高灵敏度、简单操作及普适性等方面的需求，理想的核酸标志物检测方法应具备类似ddPCR的数字式绝对定量原理，同时摆脱对微乳液滴的依赖，且满足稳定、价格低廉、高效灵敏、适用范围广等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、通用性强、无需昂贵仪器即可对核酸标志物进行数字式绝对定量的分析方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、将能特异性识别靶标核酸标志物分子的核酸探针通过基团之间的反应或链霉亲和素与生物素之间的结合负载在微球上。

2、利用步骤1中负载在微球上的核酸探针特异性地与靶标核酸标志物分子结合，使每个微球上只负载1个或0个靶标核酸标志物分子。

3、通过每个靶标核酸标志物分子引发核酸扩增和荧光信号富集，使荧光富集效率足够点亮其负载的微球，呈现阳性荧光信号；其中负载0个靶标核酸标志物分子的微球呈现阴性荧光信号。

4、利用流式细胞仪区分出阳性荧光信号微球和阴性荧光信号微球，根据阳性荧光信号微球的个数实现靶标核酸标志物的数字式绝对定量分析。

上述步骤1中，所述基团之间的反应为氨基和羧基的反应、氨基和环氧基的反应、氨基和醛基的反应、氨基和酯基的反应中的任意一种。