[发明专利]强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用

说明书

本发明涉及一种强化谷氨酸棒杆菌中丙酮酸合成L‑亮氨酸能力的方法，属于基因工程领域。本发明应用基因工程方法，为调控L‑亮氨酸合成代谢通量，在ilvBNC操纵子和leuA基因的启动子序列位点替换为P_tuf启动子；同时为进一步强化丙酮酸合成亮氨酸代谢通量，过表达关键酶基因异丙基苹果酸合成酶IPMS。构建了高效的L‑亮氨酸合成途径并弱化了谷氨酸棒杆菌L‑亮氨酸产生菌中L‑缬氨酸的合成通量。重组菌经发酵摇瓶实验，重组菌株WL‑14产28.47±0.36g/L亮氨酸，比出发菌株WL‑8的亮氨酸产量提高56.8％，而菌株WL‑14中缬氨酸积累量降低到1.78±0.21g/L。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种强化丙酮酸合成L-亮氨酸能力的重组谷氨酸棒杆菌及应用。

背景技术

作为八种必需氨基酸之一，L-亮氨酸因与L-缬氨酸和L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品工业，饲料工业和制药等工业。同时，L-亮氨酸在氨基酸静脉输液等方面的用量日益增长，是应用于临床氨基酸复合输液中不可缺少的原料之一，对维持病危病人的营养需求，抢救患者生命起着积极的作用。

L-亮氨酸的生产方法主要有提取法，化学合成法，微生物发酵法。其中发酵法具有反应条件温和，环境污染小，产品质量稳定等优点。谷氨酸棒状杆菌是一种环境友好的非致病性革兰氏阳性菌，已广泛应用于多种有机酸和氨基酸的工业生产。

在谷氨酸棒杆菌中，以丙酮酸为直接前体，涉及七步酶促反应合成亮氨酸，L-缬氨酸和L-异亮氨酸是在平行途径中合成的，并且由相同的酶催化，而L-亮氨酸是从L-缬氨酸合成的直接前体α-酮异戊酸分支出来，经过四步特定的反应生成。其中乙酰羟酸合成酶和乙酰羟酸还原异构酶组成操纵子，是支链氨基酸合成过程中重要的调控元件，α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)是L-亮氨酸合成过程中真正的限速酶。需要指出的是，IPMS对α-酮异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮异戊酸的亲和力高10倍，所以L-亮氨酸的合成优于L-缬氨酸。由葡萄糖生物合成亮氨酸的代谢途径如图1所示。由于L-亮氨酸的合成途径长，与其他支链氨基酸部分重叠的代谢途径，反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。因此，迫切需要研发构建高产量高生产强度高效价的L-亮氨酸高产菌株。

启动子是细胞转录调控中的重要元素，通过启动子工程技术精确调控基因转录已成为一种非常重要的代谢工程研究策略。众多文献表明，几种强启动子(如P_tuf，P_sod和P_gapA等)常被用于增强关键酶在目标产物合成途径中的表达，并且P_tuf启动子具有更高的表达强度。此外，表达强度稍微低启动子(如P_tac和P_trc)也经常用于调节不同基因的表达水平，从而调控代谢途径。然而一味地提高关键基因的表达水平并不一定能实现目标产量的持续提高，其合成途径中需要各个基因的相互协调和配合，要实现各个基因表达水平的平衡。