[发明专利]一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法及应用

说明书

本发明涉及一种快速简便构建植物DNase‑seq文库的方法，采用AMPure beads首先去除1000bp以上的大片段，然后利用醇沉的方法回收所有小片段用于PCR建库，建库后再一次AMPure beads片段筛选去除插入片段大于200bp的DNA用于测序。本发明通过两轮的AMPure beads筛选，即可获得用于测序的DNase‑seq文库，在建库的同时进行片段筛选，明显的缩短有效DNA片段回收的时间和步骤。该方法简便、快速，易操作，且稳定、可靠，重复性好，该方法的建立可加快DNase‑seq文库的构建，推动植物开放染色质鉴定相关领域研究的发展，具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速简便构建植物DNase-seq文库的方法，更具体的涉及一种改进的植物开放染色质区域的鉴定。

背景技术

真核生物中，基因组DNA由组蛋白包裹并进一步折叠组装成以核小体为基本单位的染色质结构，因此，基因的表达受一系列顺式调控元件和反式作用因子协同调控作用。当调控蛋白结合到DNA上时，其结合部位缺少核小体结构，染色质结构疏松，从而表现出对DNA酶（DNase I）的高度敏感性，被称为DNase I超敏感位点，这些区域也被称作开放染色质区域。这些区域的DNA序列往往与启动子，增强子，绝缘子及抑制因子等多种调控元件有关，因此，对于开放染色质区域的鉴定有利于揭示植物细胞中基因表达调控机制，尤其是植物在生长发育以及环境变化响应过程中的分子调控机制密切相关。

早期有关开放染色质区域鉴定多采用基于Southern blot的方法，该方法仅能针对少数已知位点进行鉴定。伴随着高通量测序技术的发展，2008年出现了DNase I酶解结合高通量测序的方法（DNase-seq）。2013年底，DNase-seq的替代方法ATAC-seq（assay fortransposase-accessible chromatin using sequencing）也被开发出来。这些方法的出现使得动物及人类细胞相关领域的研究发展如火如荼。

2012年，第一篇关于植物开放染色质鉴定的研究被报道出来，相关的DNase-seq方法也随即被转化应用到植物领域。然而，随后的几年中，植物开放染色质鉴定相关的报道却一直很少，仅有少数几篇报道出现在模式植物拟南芥以及少数小基因组作物水稻、番茄上。究其原因，主要是经典的DNase-seq方法步骤繁琐，流程长，不易掌握，而ATAC-seq方法对供试材料细胞核的完整度和纯净度要求又较高。

发明内容

鉴于上述内容，本发明提供一种解决和部分解决上述问题的快速简便构建植物DNase-seq文库的方法及应用。

本发明的目的是提供一种快速简便的植物DNase-seq文库构建方法。

本发明的另一目的是将这种快速简便的植物DNase-seq文库构建方法应用于较复杂的植物基因组材料。

本发明的通过以下技术方案达到上述目的：

将纯化的植物DNA片段采用AMPure beads首先去除1000bp以上的大片段，然后利用醇沉的方法回收所有小片段用于PCR建库，建库后再一次AMPure beads片段筛选去除插入片段大于200bp的DNA用于测序；通过两轮的 AMPure beads筛选，获得用于测序的DNase-seq文库。

优选地，所述AMPure beads用于去除1000bp以上大片段时，DNA与AMPure beads体积比为1:0.6。

优选地，所述醇沉方法回收小片段，采用3倍体积乙醇-20 °C沉淀过夜，有利于更高效的回收小片段，尤其是100bp以下的片段。

具体地，DNA文库构建过程采用illumina公司DNA文库构建试剂盒完成。

优选地，所述第二轮AMPure beads片段筛选在建库的最后一步进行，片段筛选系数为0.7*1.3。