[发明专利]一种基因稀有突变的高通量检测方法

说明书

本发明属于生物医药技术和分子诊断领域，具体涉及一种基因稀有突变的高通量检测方法，包括设计特异性探针；待检DNA片段化处理后连接Y型通用接头，通过特异性探针和接头通用序列组合进行目标位点的扩增富集；测序序列经过基因组序列比对；对于相同起始和终止位置的测序序列归类分析，进行测序错误过滤，经数据过滤后目标位点参考等位基因的测序深度计数a和其他等位基因的测序深度计数b，则该位点的真实突变比例为b/(a+b)。该技术通过DNA片段化、通用接头连接、特异引物与接头序列引物的多重PCR扩增以及高通量高深度测序，可对多个待检测位点进行富集平行测序，提高稀有突变定量检测分析的准确性。

技术领域

本发明属于生物医药技术和分子诊断领域，具体涉及一种基因稀有突变的高通量检测方法。

背景技术

随着对遗传病分子基础认识的不断深入，检测特异基因稀有突变的技术能力不断提高。稀有突变指的是存在于大量野生型DNA序列背景下的相对稀少的突变型DNA序列，例如肿瘤病人血液中含有的少量肿瘤突变基因DNA，治疗后癌症病人血液中残余的少量肿瘤突变DNA，孕妇血液中含有的少量胎儿DNA，嵌合体中少量不同遗传性状嵌合或混杂，初期出现的细菌或者病毒的耐药突变等等，都属于稀有突变的范畴，狭义的稀有突变一般指点突变。上述突变常常与疾病相关，或者是某个疾病发病的直接原因，或者是某种疾病发病的早期征兆或重要的生物标志物。因此，稀有突变与人类健康关系十分密切，对稀有突变的检测在无创产前诊断、疾病早期筛査以及疾病预后及治疗评价等方面具有十分积极的意义。检测突变的方法已经很多，但是多数已报道的方法只限于定性检测突变，而无法进行精确的定量检测，尤其高通量定量检测稀有突变的方法更为罕见。目前主要的几种检测方法简述如下。

1、基于毛细电泳检测的测定方法

一种是基于Sanger测序的检测技术，该方法主要是进行待检样本DNA的分离和纯化，然后针对待检测位点设计引物扩增后进行直接测序，可通过测序结果中是否存在有微量区别于野生型的等位基因，判断是否存在稀有突变。另一种是基于荧光标记的特异性核苷酸终止延伸的方法，该方法主要是针对待检测位点设计扩增引物进行目的片段PCR扩增，再针对待检测位点设计特异性延伸引物，根据待检测位点序列特点，有选择性的利用荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)中的一种替换单脱氧核苷酸(dNTP)中对应的一种核苷酸，当DNA中存在突变型DNA序列时，延伸不会在目标位点位置终止，而是会在目标位点下游数个碱基的位置终止，通过毛细管电泳检测出微量的信号。这些方法的缺陷在于毛细电泳检测背景较高时也会导致检测结果不准确，检测灵敏性较低。

2、基于突变扩增系统技术的检测方法

突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。目前该技术已成为国际上肿瘤个体化分子检测重要方法之一。该方法的缺点在于无法对稀有突变进行定量检测，也不适宜对多个位点同时检测。

3、基于digital PCR的检测方法

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析和定量。该方法需要使用数字PCR平台，增加了操作难度和检测成本。

发明内容