[发明专利]一种基因稀有突变的高通量检测方法

权利要求书

1.一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，包括

设计特异性探针，针对待检测的位点各自设计一对正链探针和负链探针，每一对探针中的正链探针位于基因序列的正链上，负链探针位于基因组序列的负链上；

构建基因组文库，待检DNA片段化处理后连接Y型通用接头，通过正向通用引物和反向通用引物进行PCR扩增完成基因组文库构建；

对基因组文库进行扩增，所述正链探针和所述反向通用引物形成扩增引物组合一、所述负链探针和所述正向通用引物形成扩增引物组合二，利用PCR引物对引物组合一与引物组合二等量混合物进行扩增，对第二轮PCR扩增产物进行高通量双端测序；其中，来自不同样本的引物组合一与引物组合二所采用的PCR引物具有不同的标签序列；定义，高通量双端测序为采用高通量测序平台的双端测序模式测序；

基因组序列比对：首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上；

测序数据分析：对于相同起始和终止位置的测序序列归类分析，此类序列统计计数为N，对于目标位点某一碱基类型计数低于10％*N则以测序错误过滤，经过过滤统计每个目标位点等位基因的测序深度，目标位点参考等位基因的测序深度计数a和其他等位基因的测序深度计数b，则该位点的真实突变比例为b/(a+b)。

2.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述的正链探针或负链探针中，每个探针的5’端部分序列是与最后标记的PCR扩增引物相一致的通用序列。

3.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述的正链探针或负链探针中，每个探针的3’端部分为与待检测位点所在5’端部分上游区域特异性结合的序列。

4.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，特异性结合序列的3’末端和待检测位点之间的间距为2-100bp。

5.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述特异性探针长度为18-36bp。

6.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述特异性探针长度为20-27bp。

7.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述正向通用引物和反向通用引物含有与Y型通用接头中分叉端相同或反向互补的序列，以实现对所有两端连接此通用接头的DNA分子进行PCR扩增。

8.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，所述DNA片段化处理后长度介于200-1000bp。

9.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，PCR扩增完成基因组文库构建中扩增循环数为6-12。

10.根据权利要求1所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，其特征在于，对第二轮PCR扩增产物进行高通量双端测序时平均测序深度大于50000X。