[发明专利]基于LAMP快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物及方法

说明书

本申请公开一种基于LAMP快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物，包括：正向内引物FIP(SEQ ID NO:1)、反向内引物BIP(SEQ ID NO:2)、正向外引物F3(SEQ ID NO:3)、反向外引物B3(SEQ ID NO:4)、正向环引物LF(SEQ ID NO:5)和反向环引物LB(SEQ ID NO:6)；本申请还公开一种基于LAMP快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的试剂盒，包含所述的引物组合物。本申请还公开一种基于LAMP快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的方法，包括：提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为DNA模板、所述的引物组合物为引物，进行LAMP反应。本申请提供的LAMP检测引物及方法可用于带病种子检测及早期诊断藤仓镰孢菌引起的水稻恶苗病。

技术领域

本申请涉及藤仓镰孢菌分子检测技术领域，具体涉及一种基于LAMP快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物及方法。

背景技术

水稻恶苗病是水稻上重要的种传病害之一。该病害自从第一次在日本发现以来，已传播到亚洲、非洲、北美地区。恶苗病的典型症状就是过度生长、叶片发黄、退绿、矮化、根和冠腐，甚至死亡。苗期病害发生会导致水稻产量减产10％至30％，严重会达到50％以上的产量损失，对水稻作物生产构成了严重威胁。一些研究表面，虽然镰刀菌属的4个种【藤仓镰孢菌(Fusarium.fujikuroi)、层出镰孢(F.proliferatum)、拟轮枝镰(F.verticillioides)和F.Andiyazi】能引起不同程度水稻恶苗病症状，但只有藤仓镰孢菌是最主要的强致病菌，引起典型症状。目前研究证实，仅赤霉素GA1、GA3、GA4和GA7对植物具有生物活性。藤仓镰孢菌是唯一产生具有活性赤霉素的种，而其它种中，不具有赤霉素产物和基因表达，可能由于基因突变，或启动子损伤。赤霉素是植物激素，促进苗的徒长。所以，恶苗病过度生长的症状与真菌分泌赤霉素密切相关。

依据发明人对浙江、安徽和江西主要水稻栽培品种上分离镰刀菌属种的结果表明，从24品种上，共获得的414个分离系中。形态学和分子形态学鉴定表明，它们被划分到6个种中，分别为藤仓镰孢菌，占81.4％；层出镰孢(F.proliferatum)，占8.44％；F.equiseti，占6.03％；F.asiaticum，占0.5％，F.incarnatum,占2.66％，F.andiyazi,占0.97％。显示了藤仓镰孢菌在南方3个省的水稻栽培区是引起水稻恶苗病的最主要病原菌。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学技术应用到植物病原病的检测，如普通PCR和实时荧光定量PCR技术已广泛应用病原菌检查，但这些技术需要依赖精密且昂贵的温度循环装置，反应试剂昂贵，而且需要专门的人员操作，检测过程复杂，因此不能满足快速检测的要求。为了解决该问题，日本学者发明了一种称为环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)，该方法需要设计能够识别保守序列6特异性位点的3个条引物对，然后用DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)进行等温扩增，通过直接观察管内颜色变化，判断病原菌是否存在。管内颜色变化是由于反应前向反应管内加入高灵敏的DNA荧光染料。依据染料特性，判断样本病原菌存在。该技术具有灵敏度高、特异性强、扩增条件简单，产物可视化等特点，已广泛应用到大豆疫霉菌、稻瘟病菌和黑白轮枝菌检测。然而，LAMP技术的关键是引物的特异性和灵敏性。基因组分析发现，在藤仓镰孢菌中与真菌毒素代谢相关的聚酮体合成酶基因(polyketide synthase gene)和非核糖体肽合成酶基因(non-ribosomal peptide synthetase gene，NRPS31)是独特的。最近，基于NRPS31基因开发了LAMP检测技术，以及基于核糖体特异性片段开发了LAMP检测技术。但这些不相关于赤霉素代谢途径。

通过基因组分析，分析赤霉素代谢途径上把赤霉素GA4转换为GA7(随后合成GA3)的去饱和酶基因启动子区域与其它种的同源序列有很多差异，因而设计LAMP引物并建立LAMP检测技术体系，不仅可具有特异性强，能快速、准确鉴定该病原菌的存在，也很好预测该菌能产生赤霉素GA4、GA7、GA3的产生。