[发明专利]一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法

说明书

本发明公开了一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒（X‑MuLV）滴度的方法，本发明以猫星形脑胶质细胞(PG4细胞)作为检测X‑MuLV的指示细胞，用空斑测定法(plaque assay)准确定量测定X‑MuLV病毒的滴度。包括如下步骤：将病毒稀释；在6孔板中的每个孔内加入细胞生长液；将不同稀释度的病毒加入细胞孔中，转移入细胞培养箱中孵育；加入培养基‑琼脂混合物培养5至6天；终止培养，染色，读取病毒空斑数；计算病毒滴度。本发明能够克服传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞是不常用的细胞株，不易获得等缺点，且具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可以应用于病毒清除研究的异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus, X-MuLV)滴度的测定方法。

背景技术

近年来，单克隆抗体（mAb）和其他重组蛋白（RPs）等生物制品已成为生物医药产业中非常重要的一类产品。现代生物制品常以动物细胞作为蛋白表达系统，以保证蛋白产物正确的构象和生物活性。其中最为常用的细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系（CHO细胞），CHO细胞或可能含有内源性逆转录病毒或可能在培养过程中污染外源性病毒[参见:1.BartalAH, Feit C, Erlandson R, Hirshaut Y. 1982. The presence of viral particles inhybridoma clones secreting monoclonal antibodies. N Engl J Med 306:1423；2.Garnick RL. 1998. Raw materials as a source of contamination in large scalecell culture. Dev Biol Stand 93:21–29.]。因此各国药监机构要求这类制品在临床实验前和生产阶段前申报材料中纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。

病毒清除/灭活验证通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除能力，其中异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus, X-MuLV)是常用的指示病毒之一。X-MuLV是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80–130 nm，是CHO细胞常见的内源性病毒，通常作为鼠源细胞逆转录病毒的模型病毒。