[发明专利]一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas的大肠杆菌基因组编辑工具，其包括用于表达核酸内切酶Cas9的质粒pEcCas，该质粒pEcCas包括cas9核酸酶基因、λ‑RED重组酶基因、araC蛋白基因、sacB基因、复制子pSC101、鼠李糖调节蛋白RhaS/RhaR基因、用于将Cas9导向辅助质粒DNA序列的sgRNA序列。该基因组编辑工具能够在B系、K‑12系大肠杆菌中实现基因组编辑，缩短了编辑周期，且宿主的适应性更广。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具及其在大肠杆菌中的应用。

背景技术

大肠杆菌作为模式微生物菌株，是分子生物学的常用宿主。在大肠杆菌中建立一种高效的基因组编辑方法极其重要。已经报道了几种在大肠杆菌中建立基于II型CRISPR-Cas系统的基因组编辑工具，pCas连用pTargetF或pTargetT是目前应用最为广泛的一套质粒。我们原先所建立的pCas/pTargetF或pTargetT双质粒系统(ECCRISPR1.0)能在大肠杆菌MG1655中实现迭代的基因组编辑，已经分享到Addgene上。但一些研究者在使用pCas后告诉我们，pCas/pTargetF或pTargetT双质粒系统在大肠杆菌Bl21(DE3)中不能工作。于是我们将pTargetT-ΔcadA或pTargetT-ΔmaeA质粒(Jiang Y,Chen B，et al.Appl EnvironMicrobiol,2015)转化至含pCas的Bl21(DE3)中后，确实未获得转化子(参见表2)，说明现有的基因组编辑工具在一些大肠杆菌如B系大肠杆菌BL21(DE3)中编辑效果不佳。我们推测pCas质粒上锚定辅助质粒pTargetF或pTargetT复制子的sgRNA在BL21(DE3)中存在渗漏转录，使得辅助质粒被切割，以至我们在含卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)双抗筛选平板上无法获得转化子。

发明内容

为了克服现有技术的双质粒CRISPR-Cas9基因编辑系统的上述缺陷，我们设计了一种新的思路，包括如下策略：1.将pCas质粒上lacI/trc启动子替换为鼠李糖诱导型启动子(rhaS/rhaR)来控制切割辅助质粒DNA序列的gRNA，避免在某些大肠杆菌比如BL21(DE3)中渗漏转录切割辅助质粒，从而能在更多类型的大肠杆菌中实现基因组编辑；2.将pCas质粒上的温敏型复制子pSC101ts更换为pSC101，使得大肠杆菌能在37℃下快速生长，避免需低温(ECCRISPR1.0为30℃)培养的限制，缩短了实验周期；3.将sacB基因添加至pCas质粒上，可用于质粒丢除时在蔗糖平板上进行反筛，代替原先的低温反筛。最终获得升级版质粒pEcCas(ECCRISPR2.0)。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种通用型的大肠杆菌基因组编辑工具。其包括如下技术方案：

一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具，其包括用于表达核酸内切酶Cas9的质粒pEcCas，该质粒pEcCas包括cas9核酸酶基因、用于提高编辑效率的λ-RED重组系统(或称重组酶)基因、araC蛋白基因、sacB基因、复制子pSC101、鼠李糖调节蛋白RhaS/RhaR基因、用于将Cas9导向辅助质粒DNA序列的sgRNA序列。

上述λ-RED重组系统包含Exo蛋白、Beta蛋白、Gam蛋白。λ-RED重组系统的表达可以用阿拉伯糖诱导，受到阿拉伯糖启动子的调控。

上述RhaS/RhaR基因的添加使得鼠李糖诱导型启动子替换lacI/trc启动子，以避免切割辅助质粒的sgRAN渗漏转录。

优选地，上述质粒pEcCas还包含卡那霉素抗性基因kanR。

在一种实施方式中，上述cas9核酸酶基因是化脓链球菌来源的cas9核酸酶基因，也可以是其他微生物来源的cas核酸酶基因。