[发明专利]去上皮细胞羊膜的制备方法

说明书

本发明涉及去上皮细胞羊膜的制备方法。具体地说，该方法包括以下步骤：羊膜组织的分离；羊膜组织的清洗；羊膜上皮细胞的消化，用含有胰蛋白酶及EDTA的消化液消化羊膜上皮细胞30min；羊膜上皮细胞的刮除；去上皮细胞羊膜的染色鉴定；羊膜组织的冻存。所述消化液中包含胰蛋白酶和EDTA。本发明还涉及一种去上皮细胞羊膜，其是根据本发明所述方法制备得到的。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及去除羊膜上皮细胞的方法，尤其涉及一种快速高效的去除羊膜上皮细胞的方法。

背景技术

1、在机体损伤和疾病康复过程中，受损组织和器官的修复与重建一直是生物学和临床医学面临的重大难题。据报道，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因疾病康复过程中的重要器官发生纤维化而导致功能丧失。一直以来，对于只采用药物疗法而不能得以恢复的严重损伤，不得不依靠人工脏器或器官移植来解决。然而，器官移植尽管有其巨大的治疗作用，但它依然是一种有损伤有代价的治疗方法，而且由于受到伦理以及机体免疫排斥等方面的限制，很难满足临床救治的需要。因此，借助于现代科学技术的发展，如何使受损的组织器官再生或在体外复制出所需要的组织或器官进行替代性治疗便成为生物学、基础医学和临床医学关注的焦点。

人羊膜是来源于胎儿的胚胎早期产物，厚约0.02-0.05mm，透明、有韧性，无血管、神经和淋巴管。作为胎盘的一部分，羊膜为胎儿提供可调节的符合局部运动的空间和适宜环境，通过滤过和物理缓冲作用，分泌营养因子，保持羊水中水和电解质平衡，抑制母体对胚胎的免疫反应等方式保护发生中的胚胎。羊膜主要分为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层五部分，其中上皮层为单层上皮细胞。

结膜损伤是常见的眼表疾病。以往大多采用口唇黏膜作为结膜替代物，取材繁琐，术后外观欠佳，给患者增加了一定的痛苦。而采用羊膜替代结膜重建眼表，手术程序相对简单，残存的结膜细胞能很快在羊膜上爬行生长，术后外观及功能均较为满意。羊膜自身的一些特点决定了它比较适用于眼表重建。羊膜组织因其独特的结构也在防止角膜结膜化、血管化、感染及睑球粘连等方面具有独特的作用，目前已广泛应用于眼科临床。并且经处理后羊膜组织在硬脊膜损伤、糖尿病导致的难愈性皮肤溃疡、烧伤、半月板组织工程细胞支架、阴道和宫颈发育不良等方面均具有良好的应用效果。

羊膜应用于临床前需要去除上皮细胞。然而现有方法在清除羊膜上皮细胞方面的效果不甚理想。例如，CN 109321517A(201811259326.0，九州)涉及一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，包括：一、试剂；二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞；三、羊膜间充质干细胞传代培养。据信该发明与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNase Ⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

CN110218697A(201910400511.5，南医)公开了一种羊膜干细胞提取、培养的方法，该方法包括以下步骤：(1)将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；(2)将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；(3)将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/L Ⅱ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNase Ⅰ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；(4)将羊膜消化悬液1/2X ml叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；(5)将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养。据信该发明羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高。