[发明专利]去上皮细胞羊膜的制备方法

权利要求书

1.制备去上皮细胞羊膜的方法，该方法包括以下步骤：

(1)羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

(2)羊膜组织的清洗：采用含青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml的生理盐水清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

(3)羊膜上皮细胞的消化：用消化液消化羊膜上皮细胞30min；所述消化液中包含0.3%胰蛋白酶、0.04%乙二胺四乙酸钙钠、0.25%组氨酸；

(4)羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

(5)去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；

(6)羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80°C冰箱中保存。

2.根据权利要求1的方法，其中所述消化液是照如下操作配制的：称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g乙二胺四乙酸钙钠、0.25g组氨酸倒入烧杯中，加入100ml的PBS缓冲液，轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，用0.22µm微孔滤膜过滤，得消化液。

3.根据权利要求1的方法，其中羊膜上皮细胞的消化是照如下操作进行的：

在肾形盘中放入100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的存在的冻存液或者其它物质，羊膜恢复乳白色为宜，清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落；

将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上；

用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，必要时设对照组；

在按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器内添加PBS缓冲液使容器润洗，吸去PBS，分别将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于容器底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢；

在实验容器中添加消化液，并在对照容器中添加等体积的PBS，轻轻晃动使均匀，再将其置于37℃的5% CO2培养箱中，消化30min。

4.根据权利要求1的方法，其中消化过程中使用的容器是6孔板或无菌培养皿。

5.根据权利要求1的方法，其中羊膜上皮细胞的刮除是照如下方式进行的：在烧杯中加入PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜取出，置烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液，将羊膜面向上放置在无菌平皿中，用细胞刮刀刮除残留的上皮细胞。

6.一种去上皮细胞羊膜，其是根据如下方法制备得到的：

(1)羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

(2)羊膜组织的清洗：采用含青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml的生理盐水清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

(3)羊膜上皮细胞的消化：用消化液消化羊膜上皮细胞30min；所述消化液中包含0.3%胰蛋白酶、0.04%乙二胺四乙酸钙钠、0.25%组氨酸；

(4)羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

(5)去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；(6)羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80°C冰箱中保存。