[发明专利]一种检测修复糖基化酶的生物传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种检测修复糖基化酶的生物传感器及其检测方法和应用。所述生物传感器包括茎环DNA模板以及线性引物探针；所述线性引物探针为LAMP引物探针，至少设置有4个引物探针，包括两个前正外内向引物即FIP和FOP，两个后正外内向引物BIP和BOP。所述茎环DNA模板茎区设计有待测修复糖基化酶的目标碱基；所述茎环DNA模板还设置有与上述引物探针序列互补或者序列相同的区域。本发明制备得到的生物传感器实际构建了一个自导向复制系统，可用于零背景、高灵敏、高特异地检测修复糖基化酶活性。为修复酶相关的生物医学研究和早期临床诊断提供了一个简单、稳健和通用的平台。

技术领域

本发明属于生物酶检测技术领域，具体涉及一种检测修复糖基化酶的生物传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

基因组DNA由Watson-Crick配对的杂环碱基组成，用于保存和传播遗传信息。因此维持基因组DNA的准确性和完整性是所有生物体的基本先决条件。但是基因组DNA经常受到各种内源性和外源性因子的破坏，导致每天每个细胞产生约10⁵个损伤(如修饰的碱基，无碱基位点，DNA加合物和DNA链断裂，链内和链间交联等)。持续的DNA损伤可能会严重诱导碱基替代，插入，缺失，和染色体重排，导致基因组不稳定，过早衰老，发育障碍和癌症发生。因此细胞进化出多种保护系统以特异性修复宽范围的DNA损伤，其中碱基切除修复(BER)是最重要的修复机制，其能修复氧化，烷基化，甲基化，脱氨化和水解反应引起的各种DNA损伤。DNA糖基化酶是一类最重要的DNA修复酶，它们通过切除受损碱基和DNA碳骨架之间的N-糖苷键来启动BER途径的关键第一步。DNA糖基化酶的失调与多种人类疾病密切相关，包括神经退行性疾病，免疫缺陷，低白蛋白血症，淋巴瘤，白血病，干性色素性皮肤病，卡因综合征和癌症(如肺，乳腺，胃，胆囊，膀胱，口腔和结肠癌)。因此，作为临床诊断的潜在生物标志物和抗癌治疗的药理靶标，开发能够准确、灵敏地检测DNA糖基化酶活性的方法对于致癌机制的研究和抗癌药物的研发有重要的意义。

目前为止，已经开发了多种用于检测DNA糖基化酶活性的方法。原则上，DNA糖基化酶活性的定量可以用两种模式实现：一种是通过测量释放的受损碱基的量，另一种是通过测量含有脱碱基(AP)位点的DNA产物的量。常规检测DNA糖基化酶活性的方法主要是基于前一种模式，包括高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)法。然而除了费力的操作，HPLC和MS通常还会遭受到因样品收集和制备期间产生的人为因素产生的DNA糖基化酶而导致的高背景信号。ELISA则会由于多步洗涤操作期间样品的损失而低估实际DNA糖基化酶含量水平。为了克服这些限制，后一种模式可以通过直接检测含有AP位点的DNA产物，主要方法包括比色、电化学和荧光法。尽管它们的性能有所提高，但每种方法在实际应用中都有其自身的局限性。例如：比色法需要耗时的金纳米颗粒(AuNP)探针的制备。电化学法需要繁琐的探针固定和复杂的石墨烯沉积电极的制备。基于量子点(QD)纳米传感器和DNA修复响应分子信标的荧光法能够有效检测DNA糖基化酶的活性，但它们均涉及复杂的操作。而核酸外切酶III(Exo III)，λ核酸外切酶(λexo)和核酸内切酶IV(Endo IV)等酶的引入可以用于靶信号的放大，极大地提高检测灵敏度，但是它们无法避免荧光团和淬灭分子标记的高成本以及非特异性核酸酶消化导致的低特异和高背景。最近，开发出了一系列基于酶的指数扩增方法来用于灵敏定量低丰度目标，包括聚合酶链反应(PCR)，分支滚环扩增(RCA)，指数等温扩增(EXPAR)和连接酶链反应(LCR)。PCR是一种基于热循环介导的标准酶促DNA扩增技术，但是涉及较长测定时间和精确热循环。分支RCA和EXPAR是等温的酶促扩增技术，然而需要多种工具酶(即聚合酶和切口酶)，且操作复杂，实验成本高。另外，PCR，分支RCA和EXPAR都是两种或一种引物依赖性扩增技术，无法避免非特异性扩增产生的交叉污染。而LCR是基于热稳定DNA连接酶介导的杂交DNA探针相邻重复性的循环连接，但是LCR产物分析总是受到电泳分离的挑战。