[发明专利]一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法

权利要求书

1.一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；

S2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点TSS区域长600bp，即-499-100bp的启动子序列；

S3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI的序列如SEQ ID:NO:3所示；HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:4所示；

S4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；

S5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；

S6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；

S7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；

S8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜；

S9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；

S10、质粒小量提取试剂盒提取质粒。

2.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于，还包括以下质粒鉴定步骤：

S11、质粒通过经限制性核酸内切酶双酶切初步鉴定，并进一步送测序公司测序对所构建质粒序列进行，并命名为pPDGFB-luc。

3.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：

所述步骤S3中，引物Primer F包含KpnI的序列如SEQ ID:NO:5所示，引物Primer R包含HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:6所示。

4.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤S8中，LB培养基中AMP 的含量为80mg/L。

5.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤S11中，测序送至上海invitrogen公司进行。

6.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述小鼠PDGFB基因的转录起始位点TSS区域长600bp，即-499-100bp的启动子序列如SEQ ID:NO:1所示。

7.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述质粒序列，即pPDGFB-luc的序列如SEQ ID:NO:2所示。