[发明专利]一种检测人CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒

说明书

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种检测人CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒。该试剂盒包括CYP2C9*2引物及其探针、CYP2C9*3引物及其探针、VKORC1引物及其探针、内控引物及其探针。本发明使用特异的引物、探针获得了具有较高扩增特异性和成本较低的扩增试剂，本发明试剂盒操作简便，特异性强，灵敏度高，可配合自动化仪器检测。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种检测人CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒。

背景技术

华法林是临床常用的治疗血液栓塞性疾病（如深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换、肺栓塞等）的一线口服抗凝药，年处方量占人口总数的0.5%~1.5%，于上个世纪50年代问世以来，已作为抗凝药在市场应用了半个多世纪之久，因为其成本低，抗凝效果显著，目前依然是血液栓塞病人作为抗凝药的首选。但其治疗的窗口期窄，一直以来成为FDA药物不良反应监测系统最常报道的一种药物。

CYP2C9（细胞色素P450超家族2C9）是华法林的最主要代谢酶。目前，已发现的CYP2C9等位基因有32种，CYP2C9*1为野生型基因，其它对临床药物代谢影响较大的CYP2C9基因突变位点有CYP2C9*2、*3、*4、*5、*13等，其中前2个位点突变会导致CYP2C9酶的功能减弱，对华法林的用药剂量能力以及清除能力大大降低。VKORC1是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，华法林主要通过抑制该酶，干扰维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的羧化，使凝血因子无法活化，从而达到抗凝目的。VKORC1-1639位G/A多态性导致其启动子活性不同，进而导致VKORC1蛋白表达量下降，凝血因子生成量减少，进而指导华法林用药剂量的改变。因此鉴定人CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1三个关键位点的基因型，可以为医师对患者指导华法林用药提供参考。

基于华法林在抗凝治疗中的个体化差异，美国食品与药物监督管理局（FDA）于2007年修订的华法林说明书，在警示部分标明CYP2C9和VKORC1基因的遗传差异可影响华法林的抗凝作用，建议在使用华法林治疗前进行CYP2C9和VKORC1的基因检测，并于2011年增加了根据基因分型选择华法林初始剂量的对照表。

聚合酶链式反应（PCR），是一种DNA的快速扩增技术，自上个世纪80年代诞生之日起，便被迅速应用于医学检测和临床检验，很快就成为医学和诊断学的主要检测手段之一。PCR技术的特点如下：一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，目的基因的量成指数形式扩增。

目前，CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的分子生物学方法有多种，主要包括高分辨率溶解曲线、基因芯片技术、DNA测序、毛细管电泳、核酸质谱和荧光定量PCR技术，其中DNA一代测序技术作为该检测的金标准，程序繁杂、设备复杂、耗时长，且灵敏度低严重制约了其在临床中的应用。核酸质谱法、高分辨率溶解曲线和基因芯片法对仪器和操作人员要求较高，临床不易推广。广州金域医学检验中心有限公司申请的专利（申请公布号：CN104988223 A）采用毛细管电泳技术进行分型检测，扩增产物需再纯化，容易造成环境污染且耗时长。荧光PCR法具有高灵敏度、特异性好、耗时短的特点，成为临床基因分型检测的主流方法。对比国内荧光定量PCR法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的专利，仍存在检测时间较长、操作复杂、无法多管分型的特点。如武汉海吉力生物科技有限公司申请的专利（申请公布号：CN 106399560 A）采用荧光定量PCR单位点多管分型，操作复杂、耗时长、液体试剂-20℃保存。沈阳优吉诺生物科技有限公司申请的专利（申请公布号：CN 104962609 A）检测位点不全面、扩增程序复杂，耗时长。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测人CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒。该试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、可配合自动化仪器检测的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：