[发明专利]对T细胞低敏感性的靶细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对T细胞低敏感性的靶细胞及其制备方法和一种利用所述靶细胞体外评价CAR‑T细胞有效性的方法。所述方法在于通过敲减表面靶细胞HLA表达，使靶细胞对CAT‑T细胞敏感度降低，在进行体外筛选评价CAR‑T细胞产品时可有效减少假阳性的发生，有利于CAR‑T产品的前期研究。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对T细胞低敏感性的靶细胞及其制备方法和一种利用所述靶细胞体外评价CAR-T细胞有效性的方法。

背景技术

目前基因编辑的免疫细胞已经在肿瘤治疗中取得优异的成绩，基因编辑的免疫细胞治疗产品的早期筛选和临床前疗效评估缺少不了体外杀伤结果的辅助，但是我们在进行免疫细胞治疗产品尤其是CAR-T细胞治疗产品筛选时发现，实验室培养的肿瘤细胞大多对免疫细胞如T淋巴细胞敏感，这就导致未编辑的免疫细胞与编辑/改造后的免疫细胞在杀伤效果上差异不显著，甚至对于非目标靶点肿瘤细胞造成非特异性杀伤的“假阳性”。这样便会使得对体外CAR-T的杀伤效果造成不客观的评价，容易误判或错判。

因此为了减少这种非特异性杀伤带来的不利影响，我们尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑手段敲除靶细胞表面HLA (human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)表达，以期望降低CAR-T细胞对靶细胞(不表达对应抗原)的非特异性杀伤，提高CAR-T细胞治疗的特异性，实现更精准的治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种对T细胞低敏感性的靶细胞的制备方法及其制备靶细胞，所述的对T细胞低敏感性的靶细胞在体外筛选评价CAR-T细胞产品时可有效减少假阳性的发生。

为了实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种对T细胞低敏感的靶细胞的制备方法为通过破坏靶细胞表面的HLA表达，降低靶细胞对T细胞的敏感性。

为了实现上述目的，我们对靶细胞表面的B2M基因进行敲除。B2M也称之为β₂微球蛋白，是MHC分子的一个组件,是几乎在所有有核细胞表面均表达的与主要组织相容性复合体(MHC)I类重链相关的血清蛋白,而HLA是MHC的表达产物。

进一步，采用基因编辑技术敲除针对如SEQ ID NO：1所示的靶向序列，设计gRNA。进一步，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步，所述方法为以下步骤：

1)设计合成上下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示，退火成双链的gRNA；

2)酶切载体质粒，构建带gRNA的表达载体；

3)将步骤2中获得的表达载体转导靶细胞，获得对所述对T细胞低敏感的靶细胞。

某些实施例中可采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。目前，该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

进一步，上述制备方法制备得到的对T细胞低敏感性的靶细胞。

进一步，所述靶细胞为SKOV3、Hela和K562。

本发明的目的之二在于提供一种利用所述的靶细胞体外评价CAR-T细胞有效性的方法，使用该评价方法可在体外对CAR-T的杀伤效果进行更真实的评价，有利于CAR-T产品的前期研究。

为了实现上述目的，本发明采用以下方案：