[发明专利]产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用。所述的重组谷氨酸棒状杆菌通过导入HA合成酶基因hasA，UDP‑GlcUA合成所需的两个关键酶基因UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶gtaB和UDP‑葡萄糖脱氢酶基因tuaD，并导入三联启动子P_tac‑P_tuf‑P_gro构建得到。本发明的重组谷氨酸棒状杆菌为食品级安全菌株，透明质酸的产量达15.7g/L，远高于同类重组工程菌的合成水平，在透明质酸发酵工业上具有良好的产业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程菌技术领域。

背景技术

透明质酸分子(Hyaluronic acid，HA)由D-葡萄糖醛酸(D-glucuroic acid，GlcUA)和N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成，广泛分布于脊椎动物组织及细胞外基质中，在玻璃体、关节滑液、结缔组织、皮肤及脐带中含量较高。由于具有优良的生物相容性、吸水性、粘弹性、非抗原性和降解无毒性等，透明质酸被广泛应用于外科、风湿病科和泌尿科等领域。

几乎所有动物组织中均含有透明质酸，但是能够用于生产的原料主要为鸡冠和脐带。在这些提取原料中，透明质酸分子通常与蛋白分子或者其他粘多糖分子形成复合物，所以其提取工艺以酶解分离杂蛋白为基础。整个操作流程简单，但是提取原料来源有限，并且硫酸软骨素等粘多糖的共存致使其提取收率低，提纯难，成本高，不适合大规模生产。相比于组织提取法，微生物发酵生产具有诸多优势：原料来源获取容易，成本大大降低，适合大规模工业化生产，生产的产物分子量较高，疗效好。链球菌也能够产生透明质酸，但是链球菌自身的致病性，以及溶血素及透明质酸酶等代谢产物的分泌，限制了野生链球菌进一步发酵应用。因此，构建一种安全经济，营养要求低，产量高的产透明质酸基因工程菌已经成为迫切需要解决的问题。

DeAngelis等在A组化脓链球菌中分离到3kb碱基序列，实验证明该序列可以指导HA的异源生物合成，通过构建质粒在E.coli SURE中克隆表达该序列，最终HA产量最高达到80mg/L(Deangelis P L,Papaconstantinou J,Weigel P H.Isolation of aStreptococcus pyogenes gene locus that directs hyaluronan biosynthesis inacapsular mutants and in heterologous bacteria[J].J Biol Chem,1993,268(20):14568-71.)。Mao等在大肠杆菌中克隆表达多杀巴斯德菌HA合酶与大肠杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因，实现的HA的高产合成，摇瓶产量达到0.5g/L(Mao Z,Shin H-D,Chen R.Arecombinant E.coli bioprocess for hyaluronan synthesis[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,2009,84(1):63.)。Winder等筛选不同种属的链球菌的透明质酸合成酶基因，分别用于构建优化重组枯草芽孢杆菌的HA表达，最终优化产量达到链球菌生产水平(Bill W,Régine B,Steve V D,et al.Hyaluronic acid production inBacillus subtilis[J].AppliedEnvironmental Microbiology,2005,71(7):3747-52.)。Kaur等在乳酸乳球菌中构建HA合成途径，通过敲除乳酸代谢路径，最优HA产量达到3.03g/L(Kaur M,Jayaraman G.Hyaluronan Production and Molecular Weight is Enhanced inPathway-engineered Strains of Lactate Dehydrogenase-Deficient Lactococcuslactis[J].Metabolic Engineering Communications,2016,3:S2214030116300037.)。CN110305827A利用谷氨酸棒杆菌构建透明质酸重组工程菌，摇瓶产量优化达到9.0g/L。上述基因工程菌虽然都能够表达透明质酸，但是其产量均比较低，不适合产业化生产。