[发明专利]产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌中导入HA合成酶基因hasA，UDP-GlcUA合成所需的两个关键酶基因UDP-葡萄糖焦磷酸化酶gtaB和UDP-葡萄糖脱氢酶基因tuaD，并导入三联启动子P_tac-P_tuf-P_gro，P_tac-P_tuf-P_gro序列如SEQ ID NO.1所示，hasA序列如SEQ ID NO.2所示，tuaD序列如SEQ ID NO.3所示，gtaB序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌Bacillussubstilis168基因组DNA为模板，扩增tuaD基因与gtaB基因片段；

(2)利用EcoRⅠ和EcoRⅤ双酶切质粒pXMJ19，回收纯化5.3Kb片段；

(3)合成HR1-P_tac-P_tuf-P_gro-hasA-HR2基因元件，包括20bp的pXMJ19同源序列，三联启动子P_tac-P_tuf-P_gro密码子序列，hasA基因序列及tuaD同源序列，HR1-P_tac-P_tuf-P_gro-hasA-HR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)通过Gibson assembly将步骤(1)中纯化回收的tuaD，gtaB基因片段与步骤(3)中合成的HR1-P_tac-P_tuf-P_gro-hasA-HR2基因元件连接到步骤(2)双酶切回收的质粒载体pXMJ19，获得重组质粒pXHA；

(5)将重组质粒pXHA转入谷氨酸棒杆菌电转感受态，筛选阳性克隆，得到重组工程菌Cg/pXHA。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，利用引物tuaDFor和tuaDRev扩增tuaD基因，利用gtaBFor和gtaBRev扩增gtaB基因片段，其中tuaDFor：5’-ggtaacgatcttcaagtaaaggaggaaagtggtacatgaaaaaaatagctgtc-3’；tuaDRev：5’-cgagcctagcagccggcagcttcaaccaagtaacactttttctttttataaattgacgcttcc-3’；gtaBFor：5’-gctgccggctgctaggctcgatcataaggaaggtgccttttaaatgaaaaaagtacgtaaag-3’；gtaBRev：5’-gccaaaacagccaagctgtttagatttcttctttgtttag-3’。

4.根据权利要求1所述的产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌生产透明质酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

按1％～10％的体积比将重组谷氨酸棒杆菌种子液接种在发酵培养基中，30℃，动态培养，得到含有透明质酸的发酵液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖30～80g/L，酵母提取物8-20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁2g/L，余量为水。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，动态培养的转速为200r/min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，动态培养时间为24～72h。