[发明专利]酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用

说明书

本发明公开了一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用，本发明的重组人源I型胶原α1链蛋白，由N端亲和纯化标记、人源I型胶原蛋白α1链成熟肽序列及C端亲和纯化标记组成，在其两端设计的双特异性亲和纯化标记，有利于该重组蛋白的纯化，也有利于其检测及全长鉴定。本发明首先在基因水平上利用毕赤酵母惯用密码子优化胶原基因序列并人工全基因合成，然后通过PCR、酶切、连接等构建成重组载体，并整合进酵母染色体中，构建成分泌表达重组人源I型胶原α1链蛋白的重组毕赤酵母工程菌。本发明的重组人源I型胶原α1链蛋白携带的双特异性亲和纯化标记，可进行两步特异性纯化，易于得到高纯度的产品。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种酵母重组人源I 型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类蛋白质家族，约占动物机体总蛋白的30％左右。其中I型胶原蛋白在目前已发现的29中胶原蛋白中含量最高，约占90％。它在新组织的形态发生和细胞代谢中，赋予新组织机械强度和生化特性；其主要分布于皮肤、角膜、肌腱等部位，其对维护细胞、组织等的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。

I型胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、无细胞毒性、抗氧化性等功能，并能促进细胞粘附和细胞增殖等功效，可广泛应用在医学、美容、化妆品、保健品等领域中。其在皮肤损伤修复、整形美容、增强机体免疫力等方面的作用也已获得共识。

目前国内虽已有重组人I型胶原蛋白的相关研究，如西北大学和华南理工大学均有有关I型胶原蛋白短肽的研究报道，但其主要研究胶原蛋白短肽片段，尚无有关重组人源I型胶原α1 链全长肽的报道。根据目前研究成果已知，重组天然胶原蛋白短肽片段易降解更短的短肽，且因其结构相似性，难以检测其纯度。而重组人源I型胶原α1链全长肽，因肽链更长，更容易发生降解，更难保证产品中的胶原是否为全长肽，限制了其广泛应用。

目前市场上已流通的重组I型胶原蛋白肽段，虽已表现出较优的功效，但因其片段较小，分子量低，也限制了其功能的发挥。I型胶原蛋白全长肽因其具有更高的分子量，拥有独特的生理生化特性，如其易形成一层透气的薄膜、抗降解时间长、交联后交联度更高，性能更优异；且其随时间推移发生的缓慢降解，可以更持久的补充胶原蛋白短肽，甚至与某些药物结合可以起到缓释作用。因此，为了充分开发其潜在价值，亟需解决其全长肽的生产与全长肽链的检测问题。

目前胶原蛋白的分离纯化，多采用分子筛和离子交换树脂进行分离，而胶原蛋白因其独特的G-X-Y结构使其很难分离开，尤其与同种胶原的降解片段，且该提纯工艺操作复杂及不同批次间提纯工艺难以稳定，导致市场上胶原蛋白短肽产品多为短肽及其降解物的混合物；而亲和纯化技术因其特异性识别，可得到纯度更高的产品，且操作简便，有望解决其纯度难以提高及提纯工艺难以稳定的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白，所述重组人源I型胶原α1链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组人源I型胶原α1链蛋白包括N端的Strep-Tag II序列、人源I型胶原蛋白α1链成熟肽序列和C端的6×His序列，使其含有双特异性亲和纯化标记；全长为1071个氨基酸。

较优化地，所述重组人源I型胶原α1链蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO.2所示。

较优化地，所述人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列是经利用宿主惯用密码子将天然胶原蛋白基因序列优化后得到的，基因序列如SEQ ID NO.3所示。

较优化地，一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白的合成方法，包括以下步骤：

1)合成人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列；