[发明专利]酵母重组人源I型胶原α1链蛋白、合成方法及其应用

权利要求书

1.一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白，其特征在于：所述重组人源I型胶原α1链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组人源I型胶原α1链蛋白包括N端的Strep-TagII序列、人源I型胶原蛋白α1链成熟肽序列和C端的6×His序列，使其含有双特异性亲和纯化标记；全长为1071个氨基酸。

2.根据权利要求1所述的酵母重组人源I型胶原α1链蛋白，其特征在于：所述重组人源I型胶原α1链蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的酵母重组人源I型胶原α1链蛋白，其特征在于：所述人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列是经利用宿主惯用密码子将天然胶原蛋白基因序列优化后得到的，基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种酵母重组人源I型胶原α1链蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)合成人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列；

2)制备含有Strep-TagII编码序列的改造质粒pPIC9ks；

3)双酶切改造质粒pPIC9ks，构建含有重组人源I型胶原α1链蛋白基因的重组质粒pPIC9k-colIα1；

4)将重组质粒pPIC9k-colIα1用限制性内切酶SalⅠ线性化，并将其电转化入毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，以营养缺陷型标记和G418抗性标记筛选高拷贝阳性重组子，得到毕赤酵母基因工程菌；

5)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；

6)发酵结束后，离心纯化，得到所述重组人源I型胶原α1链蛋白。

5.根据权利要求4所述的酵母重组人源I型胶原α1链蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)合成人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列：在人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的氨基酸序列不变条件下，将人I型胶原α1链基因序列中对应的毕赤酵母不常用的密码子优化为毕赤酵母偏爱性密码子；再通过全基因合成人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列；

2)制备含有Strep-TagII编码序列的改造质粒pPIC9ks；

a)首先以pPIC9k质粒为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，产物长度为394bp；其中P1的基因序列如SEQ ID NO.4所示，P2的基因序列如SEQ ID NO.5所示；

b)对获得的PCR产物和pPIC9k质粒分别做EcoRI和BamHI双酶切，并经T4 DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，得到改造质粒pPIC9ks；

3)构建含有重组人源I型胶原α1链蛋白基因的重组质粒pPIC9k-colIα1：

a)以步骤1)中合成的人源I型胶原蛋白α1链成熟肽的基因序列为模板，利用引物P3、P4进行PCR扩增，得到长度为3194bp的基因片段；其中P3的基因序列如SEQ ID NO.6所示，P4的基因序列如SEQ ID NO.7所示；

b)对步骤2)中得到的改造质粒pPIC9ks做ApaI和NotI双酶切，获得载体片段；

c)以P5、P6为引物，以自身为模板，通过PCR相互扩增，得到含有6×His编码序列的基因片段，长度为65bp；其中P5的基因序列如SEQ ID NO.8所示，P6的基因序列如SEQ ID NO.9所示；

d)将步骤a)、步骤b)、步骤c)中的各片段混合，利用即用型无缝克隆试剂盒连接，50℃连接1h，得到含有Strep-TagII编码序列、人源I型胶原蛋白α1链成熟肽基因序列、6×His编码序列的重组质粒pPIC9k-colIα1；

4)将重组质粒pPIC9k-colIα1用限制性内切酶SalⅠ于37℃线性化，并将其电转化入毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，以组氨酸缺陷型标记和G418抗性标记筛选高拷贝阳性重组子，得到毕赤酵母基因工程菌；

5)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养：将步骤4)中制备的毕赤酵母基因工程菌接种于YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜活化培养，而后转接于BMGY培养基，于30℃、220rpm培养该工程菌16-18h，至OD₆₀₀＝2.0-6.0；室温下1500g离心5min，收集菌体；再用10mL的BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀＝1.0左右，将所得的菌液置于100mL无菌三角瓶中，于28℃、220rpm下继续振荡培养；每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1％进行诱导培养；

6)发酵结束后，取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清；在非变性条件下，用Ni-NTAHis Bands树脂吸附重组胶原，用洗涤液洗去杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统脱盐、浓缩；再将浓缩液用Strep-Tactin树脂吸附重组胶原，用洗涤液洗去杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统脱盐、浓缩，所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得所述重组人源I型胶原α1链蛋白。