[发明专利]一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法

说明书

本发明一方面提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，该方法通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定，其中，该gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；本发明的另一方面是提供伯克霍尔德菌属内“种”水平的一体化检测试剂盒，该试剂盒包括序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对。综上所述，本发明可用于药品、化妆品、食品安全质量控制中伯克霍尔德菌污染物的检测和鉴定。

技术领域

本发明涉及伯克霍尔德菌检测领域，具体涉及一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法。

背景技术

伯克霍尔德菌属(Burkholderia)是伯克氏菌科的一个属，为革兰阴性杆菌，其中洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)最为常见，该菌株存在范围广，可以促进生物膜的形成，是药品、化妆品和食品安全质量控制中的高风险污染物。

《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)是细菌分类鉴定的金标准，伯克霍尔德菌属共收载16个“种”的菌株信息，其中洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)、多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)、稳定伯克霍尔德菌(B.stabilis)、越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)等隶属于洋葱伯克霍尔德菌复合体(BurkholderiaCepacia Complex,BCC)，是目前的关注热点。BCC是伯克霍尔德菌属内一类表型近似，但在基因型上存在差异的菌群总称，由于此类菌株的表型极其相似，BCC无法通过常规的显微镜检、生化鉴定等表型鉴定手段鉴别区分，对于它们的分类学多基于基因型鉴定水平。由于伯克霍尔德菌属16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因序列的同源性高达98％～100％，导致以16S rRNA基因作为通用鉴定靶点的方法存在局限性，难以进行“种”水平的鉴定。

定位于基因组上的保守性、单拷贝功能基因序列是进行菌株“种”水平鉴定的良好靶点，其中以DNA促旋酶亚基B基因(DNA gyrase subunit B gene，gyrB gene)较为常见，以gyrB基因为靶点，开展短乳杆菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌、地衣芽孢杆菌、克罗诺杆菌等种属的鉴定和分类研究已被广泛报道，但未见其在伯克霍尔德菌属内菌株鉴定的相关研究。已公开的UP-1E/APrU引物对可以扩增gyrB基因片段，但扩增产物的长度约1000bp(较长)，不利于后续核酸测序结果的准确性；另外，该引物对中含有较多的兼并碱基(无法用作测序引物)，需要设计另外的测序引物进行核酸测序，操作不便。因此，目前在伯克霍尔德菌属内菌株鉴定上需要操作准确、简单和特异性强的扩增gyrB基因片段的引物对。

发明内容

本发明为了克服现有技术的缺陷，提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法。本发明在菌株获取量较少的情况下，收集整理gyrB基因特征参比序列，根据建立的DNA特征序列鉴定方法；设计制作伯克霍尔德菌属内“种”水平检测的一体化检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定；

其中，该gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。

进一步地，该检测方法包括如下步骤：

(1)提取实验菌株的基因组DNA；

(2)核酸扩增：配制扩增体系，在94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min的反应体系中进行扩增；