[发明专利]一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法在审
| 申请号： | 201911109114.9 | 申请日： | 2019-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN110628927A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 冯震;杨美成;秦峰;蒋波;杨燕;李芳;肖珊珊 | 申请（专利权）人： | 上海市食品药品检验所 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 31272 上海申新律师事务所 | 代理人： | 高振红 |
| 地址： | 200120 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 试剂盒 一体化检测 扩增引物 食品安全 检测 质量控制 菌属 可用 扩增 引物 化妆品 污染物 | ||
1.一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定；
其中，所述gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提取实验菌株的基因组DNA；
(2)核酸扩增：配制扩增体系，在94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min的反应体系中进行扩增；
(3)核酸测序鉴定：配制扩增体系，将PCR产物纯化后进行单链扩增，纯化单链扩增产物后，按照核酸测序仪标准操作规程操作，上机测序；
(4)聚类分析：根据核酸序列比对算法的优化结果，选择统计学计算方式，采用邻接法构建NJ进化树，聚类分析“属”内各个“种”之间的进化关系。
3.根据权利要求2所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的扩增体系包括：
4.根据权利要求2所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的扩增体系包括：
5.根据权利要求2所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，步骤(3)单链扩增的反应程序为：96℃1min，96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，4℃保温。
6.根据权利要求2所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中采用醋酸钠沉淀法或试剂盒法对单链扩增引物进行纯化。
7.根据权利要求2所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，其特征在于，步骤(4)所述的统计学计算方式选自Bootstrap Method(1000)、Kimura 2-ParameterModel、Uniform Rates或Pairwise Deletion中的一种或几种。
8.伯克霍尔德菌属内“种”水平鉴定的一体化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的gyrB基因扩增引物对。
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