[发明专利]一种生产海藻糖的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种生产海藻糖的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程及发酵工程领域。为了解决目前生产海藻糖需要人为提供有机碳源作为原料，提高了生产成本的问题，本发明提供了一种生产海藻糖的基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌是蓝细菌过表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase与麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase以及海藻糖转运蛋白TRET1获得的。本发明在光合自养微生物蓝细菌中实现由太阳能直接固定二氧化碳合成海藻糖。海藻糖合成能量的来源是太阳能，碳源的来源是二氧化碳。因此利用本发明方式合成的海藻糖与传统的生产方式相比不会受到原料和能量不足的限制，同时也不会增加碳排放，是真正意义上的零排放海藻糖产品。

技术领域

本发明属于基因工程及发酵工程领域。具体涉及一种生产海藻糖的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

蓝细菌(蓝藻)是唯一能够进行植物型放氧光合作用的原核生物，在将二氧化碳直接转化为燃料、化学品和其他高附加值产品的生物催化剂方面拥有巨大的潜力，目前随着代谢工程和合成生物学领域的快速发展，以蓝细菌作为底盘细胞实现了多种生物燃料、生物基化学品和糖类物质合成，如蔗糖、糖原、脂肪醇、脂肪烃、脂肪酸、异戊二烯、乙醇、丁醇、异丁醛以及乳酸和氢气等。

海藻糖(Trehalose)由两个葡萄糖分子以α-1,1-糖苷键连接形成的非还原性二糖，在细菌、酵母、真菌、昆虫、无脊椎动物以及植物中，都存在海藻糖的合成途径。生物体中合成的海藻糖可以作为自身的碳源和能量储备并帮助细胞应对多种环境胁迫(高温、高盐、低温、干旱等)，而工业化生产得到的海藻糖产品可作为生物制品的优良活性保护剂、提升食品品质的独特配料和保湿类化妆品的重要成分，是一种重要的功能性二糖。

海藻糖具有多种功能(碳源和抗逆性)及在多个领域(化妆品、医药、保健品)内具有广泛的应用前景，为了能够实现工业化生产海藻糖，提高其产量，降低市场价格，到目前为止科研人员已研究开发出多种方法制备海藻糖：①从生物体中直接提取：2012年，安宁等人通过紫外诱变和逆境定向筛选出发酵母菌SC2(初始菌株的海藻糖含量为48mg/g干重)获得突变株SA12(海藻糖含量为64mg/g干重，较出发菌株提高了33％)，通过优化菌株培养基(种子培养基和发酵培养基)等手段，提高胞内海藻糖含量达到149mg/g干重(产量：3.1g/L)，在40g/L NaCl胁迫后胞内海藻糖量达到227mg/g干重(产量：4.82g/L)，最终通过优化发酵模式—补料分批发酵，同时盐胁迫处理突变株SA12，采用7L发酵罐初步发酵获得23.3g/L的生物量，胞内海藻糖含量为229mg/g干重(产量：5.4g/L)；②通过微生物发酵提取海藻糖合成酶，通过酶法合成海藻糖：日本林原生化研究所利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyl-trehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyl-trehalose trehalodehydrolase,MTHase)组成混合酶系，降解淀粉生成海藻糖；③通过微生物发酵法生产海藻糖：如2015年高超等人通过在大肠杆菌导入哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的海藻糖双功能合成酶基因(tpsp)实现该酶的成功表达，海藻糖的产量提高到1.2g/L，相对转化率为21％，通过发酵罐优化发酵条件，海藻糖的最终产量达到13.3g/L，葡萄糖的相对转化率达到48.6％。综上所述，无论是采用微生物发酵(酵母或者大肠杆菌)或者酶法合成，都必须采用糖类化合物如淀粉，葡萄糖等作为发酵底物，从而大大提高了生产成本。

发明内容

为了解决目前生产海藻糖需要人为提供有机碳源作为原料，提高了生产成本的问题，本发明提供了一种生产海藻糖的基因工程菌及其构建方法与应用。

所述基因工程菌是蓝细菌过表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因或与所述MTSase基因的同源基因，以及麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase基因或与所述MTHase基因的同源基因；

所述MTSase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；