[发明专利]一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。本发明公开的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，包括引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明方法快速、简便、特异性强、灵敏度高、性价比好。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒。

背景技术

广州管圆线虫病是一种由广州管圆线虫感染引起的食源性寄生虫病，在我国的分布十分广泛，北至黑龙江省牡丹江市，南至广东省徐闻县，西到云南省景洪市，东至福建省闽侯县均有病例报道。广州管圆线虫是一种寄生于家鼠或大鼠肺部血管的线虫，食入其Ⅲ期幼虫后可引起人体致病，主要表现为以嗜酸性粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎症反应，严重感染时可致患者死亡。广州管圆线虫生活史复杂，成虫寄生于家鼠或大鼠的肺部血管中，中间宿主为软体动物，主要包括陆地蜗牛类、淡水螺类和蛞蝓类等，而蛙、淡水蟹和鱼等可作为其转续宿主。人体主要因生食或半生食含Ⅲ期幼虫(感染性幼虫)的中间宿主或转续宿主而感染；在我国，大多数患者的感染与生食福寿螺和褐云玛瑙螺肉有关，尤其以福寿螺多见。

病原学检测是广州管圆线虫病的确诊依据，但由于患者脑脊液中虫体数量少、分布密度低以及虫体移行等原因，虫体的检出率极低。免疫学诊断方法是目前用于检测广州管圆线虫感染最常用的方法，其中ELISA是一种较为成熟的检测方法，具有较好的敏感性和特异性，但该方法不能鉴别现症和既往感染，假阳性、假阴性和交叉反应也经常出现。随着免疫学技术的发展，纯化抗原和基因工程抗原也广泛应用于广州管圆线虫病的诊断，但抗原的纯化需要足够的虫源，操作比较复杂，限制了该方法的应用。中间宿主(福寿螺等)或转续宿主(蛙、淡水蟹等)体内的幼虫检测目前采用的方法包括“肺检法”、酶消化法和直接研磨法，该类方法操作简便、成本低廉，但对于幼虫的鉴定需要有经验的专业技术人员参与，且操作花费时间较长，不适合现场大规模应用。PCR技术是近年来迅速发展起来的分子生物学检测技术，已广泛地应用于寄生虫学与寄生虫病研究领域，但由于PCR技术检测成本较高、操作繁琐以及检测时间较长等限制了其在现场的大规模应用。因此，提供一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，用于快速、简便地检测广州管圆线虫及其幼虫，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，本发明方法快速、简便、特异性强、灵敏度高、性价比好。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物探针组合物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-TACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTG-3’；SEQ ID NO.1；

下游引物：5’-TAGCGACATAGCCGCCAAATTATCATCACCATC-3’；SEQ ID NO.2；

所述探针在SEQ ID NO.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团，第33位碱基修饰淬灭基团，第32位碱基修饰四氢呋喃残基；

5’-TGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGT-3’；SEQ ID NO.3。

进一步，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。

进一步，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

进一步，一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，包括引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。