[发明专利]蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。本发明提供的蛋白质定量标记试剂利用邻苯二甲醛基团及其衍生基团与氨基的高反应活性，可以实现对赖氨酸特异性识别，利用其对赖氨酸的高反应活性和不水解的特性，可以有效提高标记效率，再通过比较报告离子的相对丰度，可将其应用于对多组含有赖氨酸的蛋白质组的定量分析中，该蛋白质定量标记试剂在水溶液中稳定，可长期保存，是新一代稳定、高效、经济的等量异位标记试剂。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学研究领域，具体地说，涉及一种蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，人类基因组序列被全部测定。但由于基因的表达方式非常复杂，同一个基因在不同的组织、环境状况下转录情况也不同，一个基因可以有多种mRNA形式剪接。并且虽然基因指导了蛋白质表达，但是蛋白质还存在复杂的翻译后修饰、亚细胞定位及迁移、蛋白-蛋白相互作用等现象，均无法从基因层面得到解释，而蛋白质这些动态变化又直接与生理或病理现象相联系。因此仅仅通过基因序列难以解释生理或病理变化机制。蛋白质作为生理功能的执行者，阐明蛋白质的动态变化能直接解释生理或病理变化的机制。为了进一步揭开生命的奥秘，后基因组时代到来，蛋白质组学为该时代中生命科学的主要研究内容之一。蛋白质组学的概念是根据“蛋白质”以及“基因组学”所衍生，最初于20世纪90年代被提出，旨在研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成及其变化规律。因为生物体内蛋白质的复杂性，要研究其组成和变化规律就需要实现对其细致的分离以及准确的鉴定。就蛋白质分离而言，可采用的方法主要包括多维反相液相色谱、二维凝胶电泳。其中二维凝胶电泳是常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。就蛋白质鉴定而言，可采用免疫和质谱分析的方式。传统生化上利用抗体-抗原特异性结合的免疫方式虽然检测灵敏度较高，但是受限于其检测通量较低，难以胜任对蛋白质组的检测。相比之下质谱是最为高效的检测蛋白质组方法，通过检测特定肽段或蛋白的高分辨质量，再与肽段或蛋白的标准质量进行比对，从而实现蛋白质的鉴定。相比于传统利用免疫的方式来鉴定特定蛋白的方法，利用质谱可以实现对蛋白质组高通量的鉴定，并且高分辨质谱也保证了蛋白质鉴定的准确性。

蛋白质研究策略分为自上而下(top down)和自下而上(bottom up)两种。自上而下的策略的工作流程是：首先将蛋白质混合物进行分离，得到兴趣蛋白。分离得到的兴趣蛋白再用质谱分析，在质谱中完整蛋白经过电喷雾而离子化，在二级质谱中碎裂而生成碎片离子，碎片离子与数据库进行比对，实现对兴趣蛋白以及其翻译后修饰的鉴定。自上而下的策略中兴趣蛋白不需经过蛋白酶切，可以更好地保证样品最原始特性，如某些翻译后修饰。但自上而下的策略也存在问题：需要预先对兴趣蛋白进行分离，难以实现高通量地分析蛋白质组；某些完整蛋白的水溶性较差，进而难以进一步使用质谱进行鉴定；质谱离子化效率会随着分子量增大而降低，限制了对分子量较大的蛋白复合物的鉴定。

自下而上的策略首先将蛋白样品酶切成肽段混合物，之后肽段混合物经过反相液相色谱分离，依此进入质谱进行检测，通过一级质谱测定肽段的完整分子量，在进入串联质谱之前，质谱将进一步电离肽段成多个碎片离子，碎片离子之后进入二级质谱被检测，最终根据所获得的二级质谱图与电脑模拟的肽段碎片离子谱进行对比，确定所检测到的肽段序列组成。这种蛋白样品不经过分离而直接水解成肽段混合物进入质谱检测的方法被称为“鸟枪法”(shotgun)，由John R Yates III于1999年首次提出。该方法也是到目前被广泛使用的蛋白质组学研究方法。