[发明专利]DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法

权利要求书

1.一种DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供待补平模板和底物，所述待补平模板包括模板链和与部分所述模板链配对结合的引物链，所述待补平模板具有第一标记，所述底物包括具有第二标记的核苷酸，所述模板链未与所述引物链配对结合的核苷酸中只有一个能与所述具有第二标记的核苷酸互补配对；具有第二标记的核苷酸在DNA聚合酶的作用下整合到待补平模板上，第二标记的核苷酸整合到待补平模板的具体位置能够使得第一标记和第二标记发生荧光共振能量转移；

将不足量的包括不同浓度的所述第二标记的核苷酸的底物分别与所述待补平模板和足量的DNA聚合酶混合，以进行不同浓度的所述第二标记的核苷酸的所述引物链的延伸反应，并采用停流光谱法检测各所述延伸反应的荧光强度变化，得到多个荧光强度变化速度；及

根据多个所述荧光强度变化速度及对应的具有所述第二标记的核苷酸的浓度，得到所述DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数；

所述DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数为具有所述第二标记的核苷酸的解离常数和结合常数；

所述根据多个所述荧光强度变化速度及对应的所述第二标记的核苷酸的浓度，得到所述DNA聚合酶的动力学参数的步骤包括：

对多个所述荧光强度变化速度及对应的具有所述第二标记的核苷酸的浓度进行线性拟合，得到线性公式，将所述线性公式与k_obs＝k_on[L]+k_off比对，得到具有所述第二标记的核苷酸的解离常数和结合常数，其中，所述k_obs＝k_on[L]+k_off中，k_obs为荧光强度变化速度，[L]为具有所述第二标记的核苷酸的浓度，k_on为具有所述第二标记的核苷酸的结合常数，k_off为具有所述第二标记的核苷酸的解离常数。

2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述第一标记为荧光供体基团和荧光受体基团中的一种，所述第二标记为荧光供体基团和荧光受体基团中的另一种。

3.根据权利要求2所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述荧光供体基团选自Alexa Fluro 350、Alexa Fluro 448、Alexa Fluro 546、Alexa Fluro 555、Alexa Fluro 568、Alexa Fluro 594及Alexa Fluro647中的一种；

及/或，所述荧光受体基团选自Cy5、Alexa Fluro 488、Alexa Fluro 546、Alexa Fluro555、Alexa Fluro 568、Alexa Fluro 594及Alexa Fluro 647中的一种。

4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述待补平模板上连接有所述第一标记的核苷酸，与所述待补平模板上和具有所述第二标记的核苷酸互补配对的核苷酸的距离为0nm～560nm。

5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述引物链具有第一标记；及/或，当所述DNA聚合酶具有3'-5'外切酶活性时，所述引物链的3'端的碱基经硫代修饰。

6.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述底物还包括未标记的核苷酸，所述未标记的核苷酸的碱基与所述具有第二标记的核苷酸的碱基不同。

7.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示；及/或

所述引物链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

8.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，其特征在于，所述具有第二标记的核苷酸的结构式如下：