[发明专利]一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒及其预测方法在审
| 申请号： | 201911037580.0 | 申请日： | 2019-10-29 |
| 公开（公告）号： | CN110564858A | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 张志新;卓越;文学平;钟雪梅 | 申请（专利权）人： | 成都益安博生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 51229 成都正华专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李亚男 |
| 地址： | 610041 四川省成都*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 首轮 特异性引物 免疫检测 药物疗效 扩增 引物 高通量测序技术 分离淋巴细胞 特异性扩增 外周血样本 基因分子 可变区域 扩增产物 扩增引物 目标区域 序列信息 预测评估 提取RNA 逆转录 试剂盒 外周血 预测 多样性 评估 | ||
1.一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于进行RT-PCR扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮RT-PCR扩增引物，以及对首轮扩增产物TCR区域进行第二轮PCR扩增的特异性引物；
所述首轮RT-PCR扩增引物如SEQ ID NO.1～40所示；所述第二轮PCR扩增特异性引物如SEQ ID NO.41～50所示。
2.根据权利要求1所述的用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述辅助成分包括RT-PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、ddH2O、酶。
3.采用权利要求1或2所述的试剂盒对免疫检测点调节类药物疗效进行预测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品RNA；
(2)以待测样品RNA模板进行反转录，然后对反转录制得的cDNA进行首轮RT-PCR扩增，收集纯化扩增产物；
(3)再次对步骤(2)所得扩增产物进行第二轮PCR扩增，以扩增TCR可变区，获得可变区序列；
(4)基于步骤(3)所得可变区序列计算其D50值。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述D50值的计算方法如下：测序得到TCR可变区序列信息，比对确定可变区序列的总数记为N，与可变区基因的不同序列的类型数为C，每一种序列的拷贝数为N1、N2……NC，并按拷贝数从多到少以N1、N2……NC进行排序，拷贝数最多且占据功能性可变区序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值即为D50。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述首轮RT-PCR扩增的反应体系中的TRTmix引物由SEQ ID NO:1～4所示引物等摩尔比浓度混合，然后再稀释至20μM，或将SEQ ID NO:1～4所示引物中的各引物分别调整其浓度为20μM，然后再等体积混合；
所述Vβmix引物由SEQ ID NO:5～40所示引物等摩尔比浓度混合，然后再稀释至20μM，或将SEQ ID NO:5～40所示引物中的各引物分别调整其浓度为20μM，然后再等体积混合。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述TCR可变区序列唯一性由CDR3序列确定。
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