[发明专利]快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌引物组、试剂盒及方法，针对病原菌在铁皮石斛不同的发育时期和环境条件下所表现的症状可能一样的问题以及现有检测方法耗时久的问题。本发明利用巢氏多重PCR建立了一种对铁皮石斛上四种主要病原菌的多目标快速检测的引物组和方法，整个检测流程只需要5～6个小时，方法的检出限可以达到10^^‑14ng/μL。并在实际应用中发现与传统平板分离法相比，该方法能更快、更准确地检测病原体，甚至可以在铁皮石斛未出现病害表征时检测到相应的病原菌。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌引物组、试剂盒及方法。

背景技术

铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是兰科石斛属多年生草本植物，具有益胃生津、滋阴清热、提高免疫力、抗肿瘤、抗高血压等作用，是一种非常珍贵的中药材。20世纪80年代，铁皮石斛被国家列为重点保护的珍稀濒危药用植物，受到人们普遍重视。由于过度采挖，铁皮石斛野生资源日渐稀少，因此人工仿野生栽培受到各地重视，其中大棚种植一直以来是最主要的一种栽培模式。该模式具有设施规范、苗床规整、基质配比精细、集约化程度高等特点，容易达到高产、稳产的栽培效果。然而，因其高度密集栽培，加之大棚内长期相对闷热、阴湿的小气候环境，极易滋生病害，如炭疽病、茎腐病、疫病、叶枯病、软腐病等几乎可以常年发生，给铁皮石斛高产、稳产与品质带来极大的影响。因此，及早诊断，及早防治铁皮石斛病害，是关系到铁皮石斛产业化种植效益的重要一环。

据调查,白绢病、炭疽病、梢枯病以及叶斑病是铁皮石斛病害中四种发生频率较高的真菌性病害，引起这四种病害的病原菌分别是翠雀小核菌 Sclerotiumdelphinii,胶孢炭疽菌Colletotorichumgloeosporioides,互隔交链孢 Alternaria alternate和枝状枝孢菌Cladosporiumcladosporioides。这些病原菌长期存活于土壤，遇到适宜的气候条件时，便会造成病害的大量爆发。此外这些病害常常混合发生，存在多种病原菌复合侵染的现象，且不同的病原菌在铁皮石斛不同的发育时期，不同的环境条件下所表现的症状可能一样，仅靠人为的肉眼鉴定存在一定的困难与误差。因此，建立快速检测技术对铁皮石斛病害的防治具有重要的指导意义。随着分子生物学的发展，免疫技术和PCR技术不断引入该领域，但植物病害的病原体种类繁多，血清类型多，漏检问题难以避免，而且血清反应的特异性较差，从而使得免疫技术在大范围的实际应用中受到制约。PCR及其相关衍生技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究。巢氏PCR即两步PCR，它使用了两对PCR引物进行扩增：一对普通引物一对巢式引物，以第一轮普通引物扩增出的产物作为第二轮PCR的模板，巢式引物也是根据第一轮普通引物扩增出的片段所设计的特异性引物，因此巢氏PCR显著的提高了反应的灵敏度及特异性。多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，当体系中存在与各引物对特异互补的模板时,就会出现相应的条带。因此当巢氏PCR与多重PCR结合应用于植物病原菌的快速检测时，不仅可以提高检测的灵敏度还可以实现多种病原菌的多目标快速检测。

传统的植物病害的诊断大多依靠平板分离法，先分离出病原真菌，再对病原真菌进行鉴定，这不仅需要先进的分类学知识，而且需要时间和成本，整个过程可能需要15～20天。但在疾病的早期发现和诊断对于农民预防疾病暴发和选择准确的控制策略至关重要。因此，有必要建立一种准确、快速、经济的检测方法，用于田间植物病原菌的早期诊断。利用巢氏多重PCR所建立的铁皮石斛上四种病原真菌的快速检测体系整个流程只需要5～6个小时，并且具有高特异性、高灵敏度等优点。

发明内容

本发明利用巢氏多重PCR建立了一种对铁皮石斛上四种主要病原菌的多目标快速检测体系，并对该体系进行了优化，使得该体系的检出限可以达到10^^-14ng /μL。并在实际应用中发现与传统平板分离法相比，该体系能更快、更准确地检测病原体，甚至可以在铁皮石斛未出现病害表征时检测到相应的病原菌。