[发明专利]快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌的引物组，其特征在于所述的引物组包括四对特异性引物对，每对特异性引物对的具体引物序列如下：

特异性引物对一：

正向引物Se-F：TACACCTGTGAACCAACTG；

反向引物Se-R：CATACAAGCTAGAATCCC；

特异性引物对二：

正向引物Cl-F：GGATGTTCATAACCCTTTG；

反向引物Cl-R：TAGCGAATAGTTTCCACAA；

特异性引物对三：

正向引物Co-F：GGCGGGTAGGGTCTCCGTGAC；

反向引物Co-R：TTTGAGGGCCTACATCAGCT；

特异性引物对四：

正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT；

反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA。

2.一种快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物组。

3.如权利要求2所述的快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌的试剂盒，其特征在于还包括真菌通用引物对，其序列如下：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

4.一种快速检测铁皮石斛中四种主要病原真菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)带病植株DNA的提取：

带病植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，提取其DNA；

2)巢氏多重PCR的扩增：

第一轮PCR使用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增带病植株中病原真菌的ITS序列，其中ITS1序列如SEQ ID No.9所示，ITS4序列如SEQ ID No.10所示；

第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板，采用权利要求1中的引物组作为引物；

3)扩增结果的检测：

根据步骤2)扩增出的条带片段大小判断其对应的病原真菌；其中翠雀小核菌Sclerotiumdelphini目的片段大小为475bp；枝状枝孢菌Cladosporiumcladosporioides目的片段大小为393bp；胶孢炭疽菌Colletotorichumgloeosporioides目的片段大小为333bp；互隔交链孢菌Alternariaalternat目的片段大小为249bp。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中的DNA提取方法具体为：在打成粉末的植物组织中加入500μL 的CTAB溶液及CTAB溶液体积用量5％的β-巯基乙醇，于液氮内冷冻，再放入75℃水浴锅内融化2min，重复若干次，其中最后1次于75℃水浴锅内融化30min；接着加入500μL的DNA提取液，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，再重复上述步骤一次后加入800μL冰无水乙醇及5M的氯化钠溶液200μL沉淀1h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，自然风干后用50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用；提取的DNA用分光光度计测量OD值，使OD₂₆₀/₂₈₀控制在1.8-2.0之间，用作后续PCR模板。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)中第一轮PCR扩增体系及条件具体为：PCR反应为25μL体系，包括含Mg²⁺的10×buffer2μL，10mol/LdNTP 0.5μL，10μM/L引物ITS1/ITS43μL，2U/μLTaq polymerase0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 18.1μL；扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最终72℃延伸10min。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)中第二轮PCR扩增体系及条件具体为：PCR反应为25μL体系，包括含Mg²⁺的10×buffer 2μL，10mol/L dNTP 0.5μL，10μM/L引物Se-F/Se-R 1μL、Cl-F/Cl-R1μL、Co-F/Co-R 1.6μL、Al-F/Al-R3.2μL、2U/μLTaq polymerase0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 14.3μL；扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共20个循环；最终72℃延伸8min。