[发明专利]含miRNA mimic的人造脂质体及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种含miRNA mimic的人造脂质体及其制备方法与应用。所述人造脂质体是由具有脂质双分子层结构的脂质体与miRNA mimic混合而成；其中，miRNA mimic为人工合成的非人源miRNA及其衍生物。本发明利用包裹外源miRNA mimic的人造脂质体进行细胞外囊泡样本miRNA提取效率的表征，以及体液样本中胞外囊泡miRNA的定量分析，为囊泡miRNA应用于临床需求的稳定定量检测提供了强有力的技术支持。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种含miRNA mimic的人造脂质体及其制备方法与应用。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles，MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是外泌体。

外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含多种miRNA内含物，其表达丰度的高低可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。

检测样本中囊泡特定miRNA的表达量高低，主要受外泌体分离，外泌体RNA提取两个过程的影响。对于RNA定量分析，常用的miRNA定量分析方法主要包括内参法和外参法。内参法通过目的基因的表达量与表达量恒定的看家基因的表达量进行归一化分析，排除实验操作过程中带来的波动，进而判定目的基因的表达丰度。外参法是通过在操作过程中人为添加人工合成miRNA，提取RNA后，同时检测目的miRNA与外参miRNA的量，用目的基因的表达量与外参基因的表达量进行归一化分析，进而排除实验过程中引入的干扰因素。然而对于囊泡miRNA分析，因为现阶段缺少公认的表达量恒定的看家基因作为内参，大大限制了内参法的应用，外参法在囊泡miRNA定量分析中具有显著优势。然而现阶段基于外参法的囊泡miRNA分析，都是在囊泡分离后，RNA提取前添加游离的人工合成的miRNA mimic，最后进行归一化分析。此种游离miRNA mimic的外参法只能排除RNA提取过程中的干扰因素，而无法排除囊泡的分离阶段的干扰因素，难以用于不同样本间标志物归一化的参考，因此不能有效用于临床样本囊泡miRNA的丰度分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种含miRNA mimic的人造脂质体及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种含miRNA mimic的人造脂质体，由具有脂质双分子层结构的脂质体与miRNA mimic混合而成；所述miRNA mimic为人工合成的非人源miRNA及其衍生物。

用于制备所述具有脂质双分子层结构的脂质体的原料选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂中的至少一种。

优选地，所述具有脂质双分子层结构的脂质体中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇的摩尔比为5-8:1-3:1-3。

本发明中，非人源miRNA的衍生物为如下a)-c)中的至少一种：

a)将miRNA部分碱基用人造核苷酸碱基替代后，得到的衍生物；

b)将miRNA的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的衍生物；

c)miRNA经聚乙二醇修饰后，得到的衍生物。

miRNA mimic可以是单条，也可以是多条miRNA mimic的混合物。