[发明专利]鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。本发明以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；以待测样品cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应；再以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应；将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。本发明具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒‑乌鳢水泡病毒。

技术领域

本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

PCR即聚合酶链式反应技术，一种类似于参照细胞内的DNA复制过程。该技术是以DNA为模板，加入PCR酶以及对应的特异性引物在PCR仪器中进行程序反应，复制扩增产生新的互补DNA片段。其过程由变性-退火-延伸三个步骤组成，经过多次循环，2-3小时内就可将DNA扩增放大上百万倍。因其扩增效率高、特异性强、灵敏性高等优点，在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。

巢式PCR则是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案，与一般PCR技术有所区别的是，巢式PCR需要两对引物。内外两引物进行两次PCR扩增，第一轮扩增后，再用其扩增后的PCR产物为模板，用内引物进行第二轮扩增，得到灵敏性高，特异性更强的目的条带。

乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesicularvirus,SHVV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，Perhabdovirus属。2014年从养殖池塘的患病杂交鳢体内分离出来，该病毒能够感染鳢科鱼类、鳜鱼、黄鳝等。近年来，该病毒对一些养殖区域造成了极大危害，在一些人工养殖的池塘内，感染初期病鱼体表无明显症状，摄食减弱，体质下降；严重时停止摄食、体色变黑、眼球突出、浮于池边、时而翻滚，不久便死亡，目前尚无有效治疗方法。对于该病毒的鉴定目前没有专门的文献和技术，一般都是用普通PCR检测，特异性、灵敏性较低，出现假阳性的几率较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒-乌鳢水泡病毒。

为解决上述技术问题，本发明提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组，所述引物组包括两组引物对，其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

进一步地，所述试剂盒还包括Premix Taq。

本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，包括：

提取待测样品总RNA，以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；

以待测样品cDNA为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R，进行第一轮PCR扩增反应；

以第一轮PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R，进行第二轮PCR扩增反应；

将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。