[发明专利]鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用在审
| 申请号： | 201911006928.X | 申请日： | 2019-10-22 |
| 公开（公告）号： | CN110607403A | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 刘晓丹;张晓君;曹攀;肖自东;孙威 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11 |
| 代理公司： | 32224 南京纵横知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王玉 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 待测样品 鱼类弹状病毒 检测 分子生物学技术 琼脂糖凝胶电泳 乌鳢 总RNA为模板 水泡 成像系统 扩增条带 特异性强 巢式PCR 反转录 灵敏性 试剂盒 引物组 凝胶 判定 病毒 观察 应用 | ||
1. 鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组，其特征是，所述引物组包括两组引物对，其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Premix Taq。
4.鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，包括：
提取待测样品总RNA，以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；
以待测样品cDNA为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R，进行第一轮PCR扩增反应；
以第一轮PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R，进行第二轮PCR扩增反应；
将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。
5.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第一轮PCR扩增反应体系包括：待测样品cDNA模板1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-1F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-1R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
6.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5 min延伸，12℃降温，4℃保存。
7.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第二轮PCR扩增反应体系包括：第一轮PCR扩增产物 1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-2F 1μL、浓度为10 μM的下游引物SHVV-2R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
8.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第二轮PCR扩增反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 5 min延伸 , 12℃降温，4℃保存。
9.根据权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的试剂盒或权利要求4-8中任一所述的检测方法在鱼类弹状病毒检测中的应用。
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