[发明专利]一种检测尼帕病毒的RAA引物探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测尼帕病毒的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出尼帕病毒质粒，与亨得拉病毒质粒、口蹄疫病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒、流行性乙型脑炎病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测尼帕病毒DNA的方法，灵敏度高，每反应检测灵敏度在95％的概率下达到74copies/反应。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种RAA荧光法检测尼帕病毒的引物探针及检测方法。

背景技术

尼帕病毒(Nipah virus disease,NVD)是由尼帕病毒(Nipah virus,NiV)引起的一种烈性人畜共患病，在自然条件下可感染蝙蝠、猪、猫、犬、马、鼠、人。果蝠是该病毒的自然宿主，人类可通过与果蝠自然接触或与猪等中间宿主接触而被感染。该病毒与亨德拉病毒同属于副粘病毒科亨德拉尼帕病毒属。近年来，该病在马来西亚、孟加拉、印度等东南亚一些国家频频出现，引起人们高度关注。据统计，从1998年至2015年，世界范围内报道尼帕病毒感染的病例总数超过600例。据世界卫生组织(WHO)官网报告，2018年5月19日，印度爆发了尼帕病毒疫情，截止到7月2日，共报告病例有19例，其中17例死亡，这是自1998年以后较大的规模暴发，再次引起世人关注。

鉴于其高发病率和高死亡率，美国疾病预防控制中心将其列为最危险的生物安全4级病毒。我国规定其危害程度分类属第一类，是我国13种重点防范的外来动物疫病之一。我国尚无NVD发生的报道，但是我国南方部分地区分布有该病毒的天然宿主-果蝠；在地理位置上，毗邻东南亚和南亚地区的疫情国家，所以该病传入风险日益增高，建议加强病毒检测技术研究和监测。

现阶段尼帕的诊断方法主要分为：病毒分离鉴定、免疫组织化学法、血清抗体检测和病毒核酸检测。

1)病毒分离鉴定

该法是诊断NiV感染最基本、最可靠的方法。分离的NiV可通过免疫染色、免疫电镜、病毒中和或RT-PCR等方法进行鉴定。NiV的毒力高、传染性强，其培养及扩增有关的实验需在生物安全4级实验室(BSL-4)内进行，且所需时间较长，所以该法不适用于广泛应用及大规模流行病学调查。

2)免疫组织化学法(IHC)

该方法被证实最可靠的检测方法之一。通过福尔马林固定组织来检测病毒，可以使细胞和组织结构内的病毒抗原变得可视化，实现安全地追溯观察病毒，但是该方法判定不易标准化，对操作者的经验要求较高。

3)血清抗体检测

3.1、血清中和试验(SNT)

该方法为尼帕病实验室诊断的“黄金”标准。目前，病毒中和试验主要包括传统的空斑抑制试验、微孔板中和试验以及免疫空斑试验3种，分别通过计算空斑形成单位(PFU)、组织培养半数感染量(TCID₅₀)以及病灶形成单位(FFU)达到检测病毒抗原或抗体的目的。但是，该法需在BSL-4实验室中进行，血清也可能引起细胞毒性。

3.2、酶联免疫吸附试验(ELISA)

该方法是最经济的血清学检测方法，敏感性高，广泛应用在流行病学研究和持续监测。但是同种病毒的抗原之间密切相关，在处理外场血清时仍存在交叉反应，容易出现假阳性，对于阳性标准仍需进行SNT才能确认为阳性。

4)病毒核酸检测

4.1、传统PCR

PCR诊断被广泛用于对尼帕病毒的检测，适合对自然感染样本或流行病学样本进行检测，但是存在RNA酶和基因组DNA污染的风险。

4.2、实时荧光PCR(qPCR)