[发明专利]软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用。该方法具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测Dickeya chrysanthemi引起半夏软腐病的便捷性、及时性和准确度。引物序列为：上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。本发明采用巢式PCR(Nested PCR)对Dickeya chrysanthemi进行分子检测，检测操作简单、准确性好、灵敏度较高，国内外对该方法均未有报道。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用。

背景技术

半夏(Pinellia ternata)，为天南星目、天南星科、半夏属药用植物，为我国大宗常用药材，主要药用部位为其块茎，其燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。用于痰多咳喘，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气；生用外治痈肿痰核，是多种中成药的原料药。广泛分布于中国长江流域以及东北、华北等地区，在西藏也有分布，生长于海拔2500米以下。随着中医药事业的发展，半夏用量逐年增加，种植面积逐年扩大，但是由Dickeya chrysanthemi(GenBank登录号为MK181574)引起的软腐病目前在各大半夏产区大面积流行，该致病菌可以通过种苗、水和土壤进行传播，一旦染病，整株一周内彻底腐烂死亡，对半夏的产量和品质影响极大，同时严重阻碍了农户的种植积极性。申请人在湖北天门半夏基地调查发现，该菌导致的软腐病发病率高达70％(文献链接https://doi.org/10.1094/PDIS-03-19-0505-PDN)，目前由于该病害对半夏产业造成的影响巨大，同时缺乏中药材植物保护专业人才的指导，在半夏各大产区存在乱施滥用各类化学药剂的情况，不但未能有效防治病害，而且增加了致病菌的抗药性，加剧了环境污染，十分不符合绿色药材发展理念，同时严重威胁半夏产业的进一步发展和壮大。传统病原菌的鉴定必须在植株被致病菌侵染表现出症状后才可以开展，需要病原菌分离、纯化培养、科赫氏法则验证、形态学观察、生理生化检测等去鉴定，顺利的话完成整个过程需要大约20-30天，但是一旦产生其他杂菌污染培养基，就会影响鉴别速度，需要更长的时间，同时长时间的鉴定耽误防治时机，不利于防治的时效性。传统鉴定存在鉴定不准、耗时、费力的缺点，完全满足不了植保工作精准、快速防控的要求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用，该方法具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测Dickeya chrysanthemi引起半夏软腐病的便捷性、及时性和准确度。

本发明是这样实现的，软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物，所述引物序列为：

上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；

下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。

软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：提取软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的基因组DNA；

步骤2：以步骤1中得到的DNA为模板，利用通用引物27F/1492R进行第一轮PCR扩增；

步骤3：以第一轮扩增产物为模板，利用权利要求1所述的检测引物进行第二轮PCR扩增；

步骤4：第二轮扩增产物进行电泳检测，如果出现348bp的DNA条带，则确定所测样品中存在致病菌Dickeya chrysanthemi。