[发明专利]一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法

说明书

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，包括1)pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体构建，2)分别用pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体制备重组慢病毒，3)K562‑mbIL‑21‑4‑1BBL‑MICA滋养细胞的制备，4)PBMC细胞的提取，5)NK细胞的体外扩增；本发明提供一种NK细胞的制备方法，采用单独构建表达mbIL‑21、4‑1BBL、MICA三种分子的质粒载体，重组慢病毒感染K562的方法，制备NK细胞，制备方法解决现有技术的缺点，利用IL‑21、4‑1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞，其NK细胞扩增倍数高达890倍，制得NK细胞的纯度到达92.2％，并且不同的PBMC细胞间的扩增倍数重复性好。

技术领域

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法。

背景技术

目前，全球肿瘤的发生率呈发展迅猛的趋势，然而，传统的治疗手段，如手术，放疗和化疗不能取得良好的效果。肿瘤免疫治疗，是目前医学界公认的第四种肿瘤治疗方法。自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)，是人体固有免疫的主要效应细胞，能无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其他机制，无MHC限制性的杀伤肿瘤细胞。近年来，NK免疫治疗技术由于其无组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，副作用小，抗肿瘤活性强，正在成为一种广谱的治疗恶性肿瘤的方法。

NK细胞主要分布于外周血中，占外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的5～10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。而且，NK细胞回输到体内后不会增值，因此在肿瘤免疫治疗中通常需要比较大的细胞数量，才能达到相对较好的治疗效果。因此，如何在体外将NK细胞大量扩增是NK应用于肿瘤免疫治疗的关键之一。

目前NK的扩增主要通过2种方式进行，一种是通过IL-2、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子对NK细胞进行刺激扩增，这种方法能将NK细胞在体外扩增几十到100多倍，且纯度低，不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。第二种是通过滋养细胞刺激NK细胞扩增的方法。目前最常用的滋养细胞是经过辐照的表达IL-21和4-1BBL的K562细胞，对于NK细胞来说，IL-21能增强IFN-γ的分泌、上调NK细胞穿孔素的分泌和表达、增强细胞毒活性，同时加速NK细胞成熟和NK细胞受体表达。4-1BBL也能调节NK细胞的激活和信号转导。但是这种方法仅仅能将细胞扩增到100多倍，也存在不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。因此，亟需一种高效的扩增高纯度NK细胞的方式。

目前，已知MICA是NK细胞激活性受体NKG2D的天然配体，NKG2D为NK细胞激活提供主要信号，并能够覆盖别的NK受体接收到的抑制性信号；然而，K562细胞在稳定表达IL-21和4-1BBL分子同时能否进一步表达MICA分子有待研究，利用这三种分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK，从而提高NK的扩增倍数和纯度是本发明探讨的问题之一。

发明内容

本发明针对背景技术中提出的针对目前NK细胞扩增倍数低、纯度低、重复性差等问题，同时在本发明中利用IL-21、4-1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK细胞，用来提高NK细胞的扩增倍数和纯度也是本发明探讨的问题之一。

因此，本发明提供一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，利用K562细胞在稳定表达mbIL-21和4-1BBL分子的同时进一步表达MICA分子，制得工程细胞株，然后以钴-60辐照灭菌法对该工程细胞株进行灭菌，得到滋养细胞，命名为K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，再以K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞扩增NK细胞，制得NK细胞。