[发明专利]一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法

权利要求书

1.一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

1）pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建；

2）分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒；

3）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；

4）PBMC细胞的提取；

5）NK细胞的体外扩增；

所述制备方法具体包括：

1）pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建：

（1）利用基因合成方法，获得mbIL-21、4-1BBL、MICA基因的全长编码区序列；

（2）分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA；

2）分别用质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA制备重组慢病毒：

（1）重组慢病毒的制备；

（2）重组慢病毒的浓缩；

（3）重组慢病毒的滴度检测；

3）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；

4）PBMC细胞的提取；

5）NK细胞的体外扩增；

所述步骤5）NK细胞的体外扩增:

（1）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞在37℃条件下水浴复苏：取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次，转速为1500转/分钟，离心5分钟，弃上清，形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，备用；

（2）按体积份数计，在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞，重悬，然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅰ，将培养细胞Ⅰ液置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，进行培养，在培养至第3天时，将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基，混合均匀，形成形成培养细胞液Ⅱ，将培养细胞Ⅱ液置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，继续培养；

（3）将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时，在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x10⁶个/ml，按细胞密度比，PBMC细胞：K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例=1：1，在培养细胞液Ⅱ中加入步骤（ 1 ） 中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅲ，将培养细胞液Ⅲ置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，再次培养7天，制得NK细胞。