[发明专利]一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途

说明书

本发明公开了一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途，属于基因工程领域。本发明通过敲除普鲁兰合成酶基因同时过表达ACL基因，选育得到的出芽短梗霉重油产量明显提高。在经过以木糖为碳源发酵7天后，重组菌株重油产量达到了19.4372g/L，亲本菌株重油产量为10.0325g/L，重组菌株相比较亲本菌株提高了93.74％。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及多元醇脂(Liamocins)合成，特别涉及过表达ATP- 柠檬酸裂解酶(ACL)基因提高出芽短梗霉重油产量，重油含量有了大幅度的提升。

背景技术

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一类生活史十分复杂的多形态腐生真菌，属半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属。其在生长发育过程中有酵母状细胞、出芽孢子、肿胀孢子、厚垣孢子以及菌丝状细胞。

重油(heavy oil)是一种微生物油脂，它是出芽短梗霉的一种重要的次级代谢产物，密度比水大，一般沉积在发酵液底部。重油分为烷烃类和多元醇脂(Liamocins)，其中烷烃类重油一般是二十个碳以上的长链正烷烃，而多元醇脂类重油则是由甘露醇或木糖醇头基与3 到5个3,5-二羟基癸酸尾部相结合而成。多元醇脂的特殊结构使其具有很大的应用潜力。在医疗中对多种人类肿瘤细胞有抗增殖作用，比如肺癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞等生长都受到了抑制，并且正常细胞不受影响；在化工行业中可以作为表面活性剂和生物柴油等等；在农业中可以作为抗菌剂和杀虫剂，多元醇脂对链球菌等革兰氏阳性菌的活性有很强的抑制作用。

目前，出芽短梗霉的重油产量不高，重油的研究还处在初步阶段，分子水平的研究少之又少，因此它的合成机制还不清楚。Li等人提出重油生物合成的假设途径，并由出芽短梗霉菌株P5生成了具有单一非乙酰化3,5-二羟基癸酸酯基团的甘露醇型重油。在这种情况下，乙酰辅酶A到丙二酰辅酶A则由I型聚酮合酶(PKS)的3-酮脂酰合酶亚基(KS)催化成C4部分进入还原循环，由3-酮脂酰-ACP(KR)还原酶催化，脱水酶(DH)脱水和最后由烯酰还原酶(ER)还原。另一种丙二酰辅酶A缩合成C6碳部分进入还原循环。再由KS进行两次缩合，然后KR将其还原，产生仍与PKS结合的酰基载体蛋白(ACP)的单一3,5-二羟基癸酸酯基团。这个需要由pha G基因编码的3-羟基癸酰基-ACP：CoA转酰基酶(pha G)在 ACP衍生物中释放3,5-二羟基癸酸酯基团，然后加入甘露醇。甘露醇来自葡萄糖，甘露醇磷酸脱氢酶(MDP1)和甘露醇脱氢酶(MDH2)是甘露醇合成途径中的关键酶。由于推测的重油生物合成途径有很多不明确的地方，还需要大量的实验来进一步研究其合成机制。

此外，有研究表明，已知产重油菌株的产量受限于碳源的种类，不同的碳源重油产量差别较大。一些学者对出芽短梗霉进行发酵优化，以葡萄糖为碳源时重油产量有所提高。但其中多元醇脂的含量并不高。其他类型的碳源发酵得到的重油产量非常低，大多在4.0g/L。研究者们也试图通过遗传改造的方法提高重油的产量。其中有过表达丙酮酸羧化酶的编码基因来提高重油产量。

发明内容

本发明的目的是解决出芽短梗霉以木糖为碳源时发酵产重油能力低的问题，提供了一种提高重油产量的出芽短梗霉重组菌株及其构建方法。

为了实现上述目的，解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种提高重油产量的出芽短梗霉重组菌株，其特征在于：所述重组菌株以出芽短梗霉菌株为出发菌株，通过用柠檬酸裂解酶基因ACL替换普鲁兰合成酶基因PUL；并通过强启动子过表达柠檬酸裂解酶基因ACL实现的；

所述柠檬酸裂解酶基因ACL为内源基因，核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:1所示。

所述普鲁兰合成酶基因PUL的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述强启动子为启动子PGK。