[发明专利]一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用

说明书

本发明涉及一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用，本发明选择红耳龟线粒体基因作为目的基因，开发获得了一种特异性扩增引物KM216748F2和KM216748R2，并利用该特异性引物与ddPCR技术相结合，实现对环境中红耳龟生物量的定量检测。与现有技术相比，该引物能够与ddPCR技术相结合，实现对红耳龟线粒体基因的特异性扩增，具有针对性强的特点，此外，本发明在检测过程中不依赖标准曲线，且能够避免背景DNA中抑制剂的干扰和不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，具有更高的灵敏度和准确度。

技术领域

本发明属于环境分子检测技术领域，尤其涉及一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用。

背景技术

红耳龟（Trachemys scripta elegans ）原产于美国中部，现已被引入欧洲、非洲、亚洲及美洲等地区的许多国家，严重威胁入侵地区的生态安全，被世界自然保护联盟（IUCN）列为世界上100个最具威胁性的入侵物种之一。 红耳龟自 20 世纪 80 年代经中国香港引入我国内陆，21世纪初该种人工养殖已形成较大规模，同时因人工放生等原因进入野外自然环境，呈蔓延态势，已严重威胁栖息环境的本土龟类及生物多样性。快速掌握红耳龟野外分布状况，开展早期的预警监测，是对其进行有效防控的关键。目前，对于红耳龟的野外识别和监测，通常采用野外调查、标本采集或拍照取证，这些方法耗时费力效率低，不利于大规模快速掌握红耳龟的野外分布状况。

近些年，已有研究采用环境DNA（Environmental DNA）技术开展外来入侵物种的调查监测。环境DNA技术是在确定调查物种的特异性基因识别片段的基础上，利用各种分子手段检测环境DNA中所包含识别片段的情况，进而确定取样环境中生物的分布状况，并可以根据环境DNA浓度来推测物种生物量。环境DNA技术可以在不采集动物标本或发现动物实体的条件下监测物种分布情况，相对于传统的生物调查方法，具有标准化、灵敏度高、对生态系统干扰少、调查成本低等优势，是外来入侵物种野外调查监测研究中的有力工具。

目前，利用环境DNA开展入侵物种的调查监测时，大多采用的是荧光定量PCR(qPCR)技术。但由于提取的环境DNA通常存在一定量的PCR抑制剂，qPCR过程很容易受到抑制剂的干扰，影响其扩增效率。而且，在野外调查中，外来入侵物种的环境DNA浓度通常很低，qPCR的定量检测完全依赖于标准曲线和Ct值，当qPCR检测样本的Ct值大于30的情况下，其数据精确度和重复性都急剧下降。因此，急需开发一种更加灵敏、准确、对抑制剂更加耐受的环境DNA检测技术。

微滴式数字PCR(digital droplet PCR, ddPCR)是一种新的绝对定量技术，采用数字化终点荧光检测方式和分子计数的定量手段，不依赖于标准曲线和参照、对影响PCR扩增效率的抑制物不敏感，相对于qPCR技术，ddPCR在检测复杂背景样品中低丰度核酸序列方面更加灵敏可靠，但是目前，ddPCR技术在外来入侵物种环境DNA检测中的应用还很少。在采用环境DNA方法调查红耳龟的野外分布情况时，由于其环境DNA浓度通常很低，传统的qPCR技术在检测的灵敏性、准确性和稳定性都受到一定限制。因此，本发明提供了一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用，以提供一种特异性扩增引物序列，该引物序列配合ddPCR技术，解决了现有检测技术灵敏度、准确度和重复性都低的技术问题。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物，其特征在于，所述引物包括KM216748F和KM216748R，所述KM216748F和KM216748R的序列为：

正向引物KM216748F：5’-TCTTCTAGGGTAAATCCTATTG-3’