[发明专利]一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，包括试剂一、试剂二和封闭剂；试剂一包含引物Ft、Bt、LF、LB、dNTP、Bst DNA聚合酶和指示剂；试剂二包含Tris‑HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween‑20和甜菜碱，pH 8.8。本发明提供的试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，检测灵敏，快速准确。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒。

背景技术

霍乱弧菌是一种食源性的革兰氏阴性致病菌，在人类的小肠定植并释放蛋白类外毒素后会引起多种胃肠道疾病，如腹泻和呕吐。霍乱弧菌O1和O139血清型曾造成霍乱大流行，因此受到很大的关注。非O1/O139群的霍乱弧菌(NCVS)是河流和沿海水域中正常菌群的一部分，一直被认为是非致病性微生物。然而，在过去的几十年里，常有NCVS霍乱弧菌引起胃肠炎、肠道感染、败血症和脑膜炎的报道。因此，开发一种广谱的霍乱弧菌的检测方法势在必行。

传统的霍乱弧菌鉴定方法往往采用生化试验进行，耗时较长，并且因弧菌属的其它菌种具有相似的生理生化反应会得到假阳性的结果。随着分子生物学的发展，研究人员开发了基于PCR技术的产毒型霍乱弧菌鉴别方法，如针对霍乱毒素基因(ctx)和毒素协同调节菌毛基因(tcpA)，或者是针对溶血素基因(hylA)的荧光定量PCR方法，这些方法的优点是针对毒力基因设计引物，在检测的同时可鉴别是否含这些毒力基因，但因引物设计不是针对霍乱弧菌的共性特异性基因，不能检测所有的霍乱弧菌。

因此，提供一种能够实现实时快速高特异性检测霍乱弧菌的试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测霍乱弧菌的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据霍乱弧菌ompW基因序列(No.X51948.1)，设计一种快速检测霍乱弧菌的特异性引物对，特异性引物对的核苷酸序列如下：

Ft：TCCTTTTTTGTAGGGCTATGTTGTTGTTTGTGTGATTTTTGTGTGC；SEQ ID NO.9；

Bt：GTGTATTCTAAAGATGGAGACCACCTCACCAAAGTAGTATTGGACC；SEQ ID NO.10；

LF：ATGGCGTACGAGCGAGG；SEQ ID NO.11；

LB：CAAAACATTTGCCACCTACC；SEQ ID NO.12。

一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，包含上述特异性引物对。

优选地，一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，包括试剂一、试剂二和封闭剂；

其中，试剂一包含Ft、Bt、LF、LB、dNTP、Bst DNA聚合酶和指示剂；

试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH 8.8；

封闭剂为石蜡。

优选地，最终工作体系中，各试剂浓度为：

Ft、Bt各1.6μM，LF、LB各0.8μM，dNTP各1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10mM，氯化钾50mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。