[发明专利]一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测霍乱弧菌的特异性引物对，其特征在于，特异性引物对的核苷酸序列如下：

Ft：TCCTTTTTTGTAGGGCTATGTTGTTGTTTGTGTGATTTT TGTGTGC；SEQ ID NO.9；

Bt：GTGTATTCTAAAGATGGAGACCACCTCACCAAAGT

AGTATTGGACC；SEQ ID NO.10；

LF：ATGGCGTACGAGCGAGG；SEQ ID NO.11；

LB：CAAAACATTTGCCACCTACC；SEQ ID NO.12。

2.一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1的特异性引物对。

3.根据权利要求2的一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，包括试剂一、试剂二和封闭剂；

其中，试剂一包含Ft、Bt、LF、LB、Bst DNA聚合酶、dNTP和指示剂；

试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH 8.8；

封闭剂为石蜡。

4.根据权利要求3的一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，最终工作体系中，各试剂浓度为：

Ft、Bt各1.6μM，LF、LB各0.8μM，Bst DNA聚合酶8U，dNTP各1.4mM，Tris-HCl 20.0mM,硫酸铵10mM，氯化钾50mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。

5.根据权利要求3的一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，指示剂包括pH指示剂和/或荧光染料；pH指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，最终工作体系中，甲酚红浓度0.08mM，苯酚红浓度0.02mM。

6.根据权利要求5的一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，最终工作体系中，荧光染料为工作浓度1×水溶液的SYBR Green I或EveGreen。

7.利用权利要求2-6任一所述的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用Chelex裂解液，加热提取待检测样品的核酸；

(2)以步骤(1)核酸为模板加入试剂盒的试剂一中，后与试剂二进行混合，加入封闭液防止污染；

(3)在65-67℃的条件下，恒温扩增30-60min，显色法观察判断结果和/或利用荧光法、浊度法进行检测。

8.根据权利要求7所述的快速检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，试剂盒的工作体系为25μL，包括：试剂一1μL，pH为8.8的试剂二12.5μL和DNA模板11.5μl。

9.根据权利要求7所述的快速检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，步骤(1)中将200μL样本或样本稀释液加入2mL Chelex裂解液，充分混匀后，90℃-95℃加热10min，冷却后的上清液即可作为待扩增的核酸模板；

所述Chelex裂解液的配制：取5.0g Chelex-100和1.0ml TritonX-100溶于100ml TE缓冲液中制成；所述TE缓冲液组成为：Tris 10mM，EDTA 1mM。