[发明专利]一种快速合成全基因序列的方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公布了一种用短DNA引物拼接目标基因全长序列的方法及其应用。本发明建立的拼接技术分为两个步骤：第一，短DNA引物通过互补区相互退火，在DNA聚合酶的作用下补齐gaps，产生带有切刻位点的双链模板；第二，通过基因两端的上下游引物，以第一步反应的产物为模板，扩增全长序列。本发明还提供了一种用python语言实现的计算机算法，用以自动设计用于合成基因全长序列的短DNA引物。利用本技术在构建多重突变体基因时，仅需找到对应位点所在的DNA引物，进行碱基替换后直接用新合成的引物替换原来的引物，经过简单的PCR扩增，即可得到无模板残留干扰的突变体基因。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种快速合成基因全长序列的方法及其应用。

背景技术

要获得某一基因的DNA序列，可以从宿主的基因组DNA中PCR扩增出目标片段，也可以在DNA合成公司直接合成。前者往往需要专门购买菌株，提取基因组DNA，周期较长，操作繁琐。后者往往需要较长的周期和较高的成本，而且大多数公司返回的合成产物是重组质粒，会不可避免的引入酶切位点，对于不使用任何酶切位点的无缝同源重组的克隆方法并不适合。

Rouillard等(Rouillard J M,Lee W,Truan G,et al.Gene2Oligo:oligonucleotide design for in vitro gene synthesis[J].Nucleic acids research,2004,32(suppl_2):W176-W180.)报道了一种仅仅合成单链引物，经过相互退火，连接酶连接，然后再加入特异性的上下游引物PCR扩增，得到基因全长序列。这种方法有较高的准确性，但是由于对正、负链都要全覆盖，需要合成大量的寡核苷酸引物，并且需要体外磷酸化，合成成本较高。

进一步的，为了研究基因编码产物的功能，经常需要对基因进行突变，常见方法有重叠延伸PCR和同源重组，这两种方法都是基于特异性突变引物的，每个突变位点都需要一对特异性引物来引入突变。当需要多位点突变时，重叠延伸PCR和同源重组都需要多次连续的PCR，操作繁琐。而且新构造的突变体都需要上一步的基因做模板，最终得到的产物混有少量的其他突变型，对目标突变体的筛选产生干扰。陈立涵等建立了一种在目的基因内部构建多位点突变的方法，他们采用磷酸化引物进行反向PCR，产物经连接反应可以自连为环，甲基化后作为下一轮PCR的模板，PCR产物经DpnI处理去除原基因型，即得到新的突变体(陈立涵,等：一种快速构建基因多个点突变体方法的建立。生物化学与生物物理进展,2013,40(7):678-685)。该方法减少了干扰基因型，产物为重组质粒便于测序和表达，但仍需要多次PCR，不够简便。

发明内容

本发明旨在提供一种快速合成基因全长序列的方法，以解决上述背景中的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速合成基因全长序列的方法，包括以下步骤：

S1，第一步PCR，将相同浓度的若干条短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反应混合液中，进行PCR扩增，得扩增产物；

S2，第二步PCR，以第一步的扩增产物为模板，在高保真DNA聚合酶反应混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通过PCR反应程序，合成全基因序列；

S3，将第二步PCR的产物纯化回收，然后把回收产物与线性载体重组，转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒通过DNA测序确认合成基因的准确性。

进一步的，上述短DNA引物设计方法，包括以下步骤：