[发明专利]一种快速合成全基因序列的方法及其应用

权利要求书

1.一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，第一步PCR，将相同浓度的若干条短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反应混合液中，通过PCR反应程序，得PCR产物；

S2，第二步PCR，以第一步的PCR产物为模板，在高保真DNA聚合酶反应混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通过PCR反应程序，合成全基因序列；

S3，将第二步PCR的产物纯化回收，然后把回收产物与线性载体重组，转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒通过DNA测序确认合成基因的准确性。

2.根据权利要求1所述的一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，S1所述短DNA引物的设计方法，包括以下步骤：

步骤1，设计公式式中N代表引物数目，X代表全基因序列长度，a代表相邻引物间重叠序列的长度，a≥17，b代表引物序列的长度，b≤59，符号代表向上取整；计算需要合成的短DNA引物的数目，先令b＝59，若N为偶数，b＝59，若N为奇数，将b－1，直到N为偶数，此时b的值就是引物的长度；

步骤2，以待合成基因5’端第一个碱基起始，截取长度为b的序列作为第一条引物，从第一条引物末尾向前移动a个碱基作为下一条引物的起始，依次类推，直到目的基因末尾；

步骤3，将S2中截取的全部引物按顺序编号，当引物序号为偶数时，对其序列取反向互补,得短DNA引物。

3.根据权利要求1所述的一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，在S1中，第一步PCR的所述短DNA引物的最终浓度为20nM，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量为0.25-0.5U，dNTPs的浓度为0.15mM，所述PCR反应程序中，退火温度为55℃，延伸温度为68℃，循环数为5。

4.根据权利要求1所述的一种快速合成全基因序列的方法，其特征在于，在S2中，第二步PCR的每50uL反应体系中，所述模板的用量为1uL，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量为0.5-1U，dNTPs的浓度为0.2mM，所述PCR反应程序中，退火温度不低于60℃，延伸温度为68℃，循环数为22。

5.一种设计权利要求2所述短DNA引物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)，定义一个变量“dna”，用于储存输入的基因序列的字符串，然后将字符串中的非碱基字符去除，赋值给长度变量“seq”；

(2)，根据“seq”的长度和可指定的重叠区长度，并先假设引物的长度为59，计算所需引物数目x，x必须为偶数，否则将引物的长度减1，直到x为偶数，然后利用字符串切分的方法将“seq”逐个切分为指定长度的短字符串，直到字符串的末尾；

(3)，定义一个函数com_rev()，用于将引物按照DNA的碱基互补原则转换为反向互补序列，然后将序号为偶数的引物转换为反向互补序列，得短DNA引物。

6.根据权利要求5所述的设计短DNA引物的方法，其特征在于，所述重叠区长度指定时，至少为17bp；若不指定默认为19bp。

7.权利要求1-4任一项所述的快速合成全基因序列的方法在DNA片段合成及DNA序列突变中的应用。