[发明专利]检测非抑菌固氮菌的方法

权利要求书

1.一种检测非抑菌固氮菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)获取土壤样本，将所述土壤样本接种于Ashby固体培养基中培养；

(2)如果步骤(1)的培养结果是未出现单菌落，则所述土壤样本中不含有固氮菌；如果步骤(1)的培养结果是出现单菌落，则挑取部分或全部所述单菌落分别进行划线培养，分离获得多个单菌株；

(3)挑取所述多个单菌株中的一个单菌株接种于Ashby液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵液；

(4)去除所述发酵液中的菌株，获得去除该菌株的发酵液；

(5)将指示菌接种于种子培养基中进行培养，获得所述指示菌；

(6)将所述指示菌接种于有氮源的葡萄糖铵盐培养基中，并向部分有氮源的葡萄糖铵盐培养基中加入步骤(4)获得的所述去除菌株的发酵液，进行培养，分别获得有氮源不加该发酵液的培养液以及有氮源加该发酵液的培养液；

(7)重复步骤(3)-步骤(6)；

(8)对所有的有氮源不加该发酵液的培养液和所有的有氮源加该发酵液的培养液中的所述指示菌的生物量进行检测，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌包括：

如果部分或者所有的有氮源加该发酵液的培养液的OD₆₀₀值大于所有的有氮源不加该发酵液的培养液的OD₆₀₀值，则所述土壤样本中含有非抑菌固氮菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(9)获取该非抑菌固氮菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ashby固体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，16.0-20.0重量份的琼脂，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0；

所述Ashby液体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述去除每一个所述发酵液中的菌株为，以8000r/min对所述发酵液进行离心10min，取上清液，之后利用滤膜对所述上清液进行过滤除菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述指示菌为非固氮微生物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物为大肠杆菌或者植物乳杆菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物为大肠杆菌。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述种子培养基为有氮源的葡萄糖铵盐培养基。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述有氮源的葡萄糖铵盐培养基由以下重量份的组分制成：3.0-6.0重量份的氯化钠，0.15-0.25重量份的七水硫酸镁，0.05-0.20重量份的磷酸二氢铵，0.05-0.20重量份的磷酸氢二钾，1.0-10.0重量份的葡萄糖，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.0-8.0。