[发明专利]用于检测循环肿瘤DNA突变的质控品及其制备方法

说明书

本公开涉及一种制备用于循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测技术的质控品的方法和通过该方法制备的质控品。本公开还涉及该质控品在检测ctDNA突变和相关方法例如微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)中的用途。

技术领域

本公开一般涉及生物检测和诊断领域。具体而言，本公开涉及用于检测循环肿瘤DNA(ctDNA)突变的质控品及其制备方法。本公开还涉及上述质控品在检测ctDNA中的用途。

技术背景

循环肿瘤DNA(循环肿瘤DNA；ctDNA)是一种存在于血液中的单链或双链形式的DNA分子，其片段长度在约144-166bp。先前的研究表明，ctDNA具有许多肿瘤相关的分子生物学突变，例如序列突变、甲基化改变等。检测ctDNA中的肿瘤相关突变有助于有助于肿瘤诊断(例如早期肿瘤诊断)。不仅如此，ctDNA突变检测还可以用于监控肿瘤进展、预后以及指导用药等。

目前，用于检测ctDNA中肿瘤相关突变的技术包括微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)的方法等。基于这些方法进行ctDNA突变检测的技术越来越成熟，相关的体外诊断试剂具有广泛的临床应用价值。对于上述方法的试剂开发及性能验证、检测过程质量控制以及不同检测方法和平台结果一致性的比较，需要大量稳定的ctDNA参考品作为标准。因此，ctDNA标准品的建立显得尤为重要。

目前的ctDNA质控品制备方法通常采用超声打断或人工合成获得片段化的DNA。超声打断会对DNA造成损伤，影响检测效率和准确性，且产生的DNA片段的长度分布与真实cfDNA(细胞游离DNA；cell free DNA)/ctDNA存在较大差异。因此，本领域对于改善的ctDNA质控品制备方法存在需要。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种制备用于循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测技术的质控品的方法，所述方法包括：

a.将来自不具有目标基因突变的野生型细胞系的基因组DNA酶切消化以获得野生型DNA片段；

b.获得包含目标基因序列突变的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段，

其中获得包含目标基因序列突变的突变型DNA片段包括：

i)将来自多种突变型细胞系的基因组DNA各自酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种细胞系各自包含一种或多种目标基因序列突变；

ii)将多种质粒酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种质粒各自包含一种或多种目标基因序列突变；或者

iii)将包含多种目标基因序列突变的一种质粒酶切消化以获得DNA片段；

其中获得包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段包括：

将一种或多种细菌人工染色体DNA酶切消化并将所得的DNA片段混合，所述一种或多种细菌人工染色体各自包含一种拷贝数变异的目标基因的拷贝；

c.将来自步骤a的野生型DNA片段和来自步骤b的包含目标基因序列突变的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段混合，从而获得所述质控品。

在一些实施方案中，使用步骤b i)来制备突变型DNA片段。图1显示了通过将来自突变型细胞系例如肿瘤细胞系的基因组DNA酶切消化以获得突变型DNA片段的示意图。

在一些实施方案中，使用步骤b ii)来制备突变型DNA片段。在另一些实施方案中，使用步骤b iii)来制备突变型DNA片段。图2显示了通过将包含多种目标基因突变的单一质粒进行酶切以获得突变型DNA片段的示意图。