[发明专利]一种坯革综合毒性的检测方法

权利要求书

1.一种坯革综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；

（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；

（3）毒性检测：向浸提液中加入氯化钠，使氯化钠浓度为2.5% wt，调节pH 7.0±0.2，然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；

（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的相对发光强度；

其中，步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比为20：1~40：1，所述液固比的单位为mL/g，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜；

所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0；

所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。

2.一种坯革综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；

（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；

（3）将浸提液采用2.5% wt NaCl稀释，形成浓度梯度，使其相对发光强度范围为0%~100%，并调节pH 7.0±0.2；然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；

（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的半数相对发光强度浓度EC₅₀；

其中，步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比为20：1~40：1，所述液固比的单位为mL/g，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜；

所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0；

所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述预处理方法具体为：将坯革按照QB/T 2708-2005或四分法取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°C，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，然后切碎至4×4 mm的皮粉，恒温恒湿保存备用；所述坯革为经过鞣制、染色和加脂但尚未涂饰的坯革。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述发光细菌液的培养方法为：

（1）制备发光细菌培养基：取胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，Na₂HPO₄ 5.0g/L，K₂HPO₄5.0g/L，NaCl 30g/L，甘油3.0 g/L，去离子水溶解，调节pH至7.0；

（2）培养过程：取明亮发光杆菌T3接种于装有培养基的锥形瓶中，置于20℃、200 rpm振荡的摇床，培养18~20 h后，立即取发光效果最好的菌种二次接种，再置于20℃、200 rpm摇床，每2 h测定新鲜菌液发光强度，培养18~20 h达生长对数稳定期，用于测试。

5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液， 以2.5% wt NaCl稀释至不同菌密度，各取50 uL依次加入950 uL 0.10 mg/L HgCl₂溶液，含2.5% wt NaCl，静置15 min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt NaCl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。