[发明专利]适用于超微量DNA测序的接头及其应用

说明书

本申请公开了一种适用于超微量DNA测序的接头及其应用。本申请的接头从5’端到3’端依序包括Tag序列、PolyN序列、第一发夹互补序列、第一发夹结构序列、dUTP、第二发夹结构序列和第二发夹互补序列；第二发夹互补序列为第一发夹互补序列的反向互补序列；并且，接头的5’端具有磷酸化标记。本申请的接头，在其中设计发夹结构，使用时，接头自身形成发夹结构，然后与待测DNA进行连接，这样有效的避免了接头在与待测DNA连接时的自连，从而避免了由此造成的连接效率低的问题。本申请的接头特别适用于超微量DNA的文库构建和测序，为ctDNA的准确检测奠定了基础。

本申请是申请日为2017年05月27日、申请号为201780009071.X、发明名称为一种适用于超微量DNA测序的接头及其应用的专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及核酸序列领域，特别是涉及一种适合用于超微量DNA测序的接头及其应用。

背景技术

21世纪，随着DNA技术水平的提高，人类基因工程以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。二代测序以其高通量和高速度的优势占据目前测序行业的大部分市场。主要的二代测序平台有illumina、roche等。二代测序主要是边合成边测序的方法。目前使用的建库方法中，采用Y字形接头连接的方法引入待测DNA的两端，通过传统的PCR方法完成富集和扩增，这种传统的接头和连接扩增方法，容易造成二代测序额外错误率的发生。随着基因工程的日益发展，对测序准确性和灵敏度的要求也越来越高。

此外，1947年，Mandel和Metais在血液、滑膜液和脑脊液等体液中，发现了一种胞外DNA，主要以DNA蛋白质复合物或者游离DNA两种形式存在。到了80年代，Leon等人研究发现，肿瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人。且研究发现，在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了与原发肿瘤一致的癌基因突变。这类存在在于肿瘤患者外周血清中的DNA被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，缩写ctDNA)。ctDNA是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，可以被定性、定量和追踪。因此，理论上只需要检测患者的外周血液血浆中的ctDNA，即可简单、方便的了解癌症患者早期的基因突变信息，从而为癌症的确诊以及靶向用药提供准确的参考信息。

但是，基于ctDNA的检测技术并没有得到广泛应用；其根本原因在于ctDNA在外周血液中的含量特别低。随着肿瘤的疾病进展，ctDNA在血液中的含量也随之升高。但是，就算对于晚期的癌症患者而言，其ctDNA的含量也仅占总数的1％；早期的癌症患者外周血中ctDNA的含量甚至少到0.01％。

目前的建库方法主要是连接Y型接头，Y型接头在与待测DNA的连接过程中，易发生自连，尤其是在待测DNA微量的情况下。这种干扰会降低目的片段的连接效率，不利于含量低的ctDNA的基因检测，影响检测的准确性和特异性。因此，亟需一种能够提高检测准确性和特异性的技术，以解决ctDNA捕获测序的技术壁垒。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的特别适用于超微量DNA测序的接头及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种适用于超微量DNA测序的接头，接头从5’端到3’端依序包括Tag序列、PolyN序列、第一发夹互补序列、第一发夹结构序列、dUTP、第二发夹结构序列和第二发夹互补序列；所述第二发夹互补序列为第一发夹互补序列的反向互补序列；并且，所述接头的5’端具有磷酸化标记。