[发明专利]马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR的突变体及其应用，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第63位点进行定点饱和突变获得的。本发明构建的醛酮还原酶突变体M5‑A、M5‑L、M5‑M的比酶活较对照组醛酮还原酶分别增加了1.1倍、3.2倍、4.1倍。其中突变体KmAKR‑Y296W/W297H/K29H/Y28A/T63M对6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯、6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯等具有显著改善的催化活性。最大底物6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯投料量可达到450g/L，底物转化率高于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上，生物催化过程的时空产率高达1224.3g/L d。

(一)技术领域

本发明涉及一个源自马克斯克鲁维酵母的醛酮还原酶KmAKR的突变体构建，开发醛酮还原酶重组菌及酶在阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”侧链双手性二醇6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯手性生物催化合成方面的应用。

(二)背景技术

阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂疗效、长期安全性和临床益处，显著降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。迄今为止，阿托伐他汀钙的累计销售额已突破1000亿美元，是人类制药工业史上最成功的单一药物品种。

他汀药物大多含有6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯结构，既是重要的药效基团又是关键合成前体。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙的关键手性二醇中间体。6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯是瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”药物的合成前体。由于6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，因此，研究光学纯6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。已有文献报道的6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯合成方法主要包括化学催化6-取代-(5R/S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原和氧化还原酶差向选择性还原6-取代-(5R/S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。硼烷等化学催化剂催化还原工艺存在能耗高、转化率低、差向选择性低和生产成本高等缺陷。与化学催化剂相比，酶作为绿色天然生物催化剂，在催化化学反应中具有优越的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优点，且反应条件温和、副产物少、环境友好。但许多酶分子在催化非天然底物时，往往存在活力较低、稳定性差、底物产物抑制等问题，亟需对酶分子实施分子改造。

得益于蛋白质工程的科技进步，生物催化已广泛应用于工业化生产。在我们前期发明(CN 201710282633.X，CN 201910155559.4)的基础上，本发明通过建立高通量筛选模型，构建大容量突变体文库，筛选获得具有鲁棒性的超级突变体，其中“最佳”突变体KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M催化性能最强，进一步分析了突变体催化性能提升的分子机理，优化反应工艺参数，构建KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M催化合成6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯工艺。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有醛酮还原酶对6-取代-(5R/S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原活性不高及底物投料量低的问题，提供一种立体选择性醛酮还原酶系列突变体及利用该醛酮还原酶突变体的重组菌或其粗酶液作为催化剂，不对称还原合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯等手性醇化合物，催化剂活性较KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A提高了4.1倍，底物投料量提高至450g/L，这是所有文献报道中的最高水平。

本发明采用的技术方案是：