[发明专利]一种抗黑穗病薏苡种质的鉴定方法

说明书

本发明涉及植物抗病性分子的鉴定技术领域，尤其是一种抗黑穗病薏苡种质的鉴定方法，包括DNA提取、DNA电泳检测、PCR扩增反应、PCR扩增产物鉴定；所述PCR扩增反应采用ATP6‑F和ATP6‑R作为引物，ATP6‑F和ATP6‑R引物来源于Sporisorium和Ustilago线粒体全长序列，其中ATP6‑F是GGWGCTAGGAATCCTGMAAG，ATP6‑R是CTCTAAAYCTACCWGTACTTGG。本发明提供的鉴定方法可以准确鉴定那些被病原菌成功侵染、却不发病的薏苡材料，能从分子水平准确地鉴定出抗黑穗病薏苡种质，操作简便、检测时间短、稳定性好、容易判断。

技术领域

本发明涉及植物抗病性分子鉴定技术领域，尤其是一种抗黑穗病薏苡种质的鉴定方法。

背景技术

黑穗病是威胁薏苡产业健康发展的主要病害之一，病原菌主要危害薏苡植株穗部，也可危害茎、叶，形成病瘿。感病植株发病后，穗部子房膨大成近圆形或卵圆形，内部充满黑褐色粉状物，整株颗粒无收。种植过程中选用抗黑穗病的薏苡品种不仅可以减少薏苡种植过程中农药的投入，形成有利于生态环境的薏苡种植模式，也是薏苡产业稳定发展的内在需求。黑穗病病原菌主要侵染薏苡胚芽鞘，薏苡四叶期时侵染结束，直到总苞发育时才呈现发病状态。目前种植过程中预防黑穗病的方法主要是用包衣种或热水烫种，但这两种方法均只可以消灭种子上的黑穗病病原菌，无法消除土壤中的病原菌在种子萌发后对植株的侵染，还是常有薏苡植株感染黑穗病的情况发生。

常规抗病品种选育的方法是通过病原菌菌粉拌种或者将种子播种在含有病原菌菌粉的土壤中，调查植株成熟期的发病率，根据植株发病比例确定抗病等级。该方法不足的地方是，对于田间未表现发病的植株不确实是否被病原菌侵染，其不发病的表现很可能是由于病原菌未成功侵染该植株导致，因此，通过该方法确定的免疫或者抗性薏苡材料存在一定的假阳性；而且工作量大，周期长。

目前，已有不少关于植物黑穗病的分子鉴定方法。如申请号为CN201510968582.7的专利提供了一种薏苡黑穗病菌检测的方法，在有薏苡黑穗病病症的薏苡植株上分离薏苡黑穗病病原菌，对含有薏苡黑穗病病原菌的花苞表面进行消毒，用马丁氏培养基筛选获得单孢菌落，然后用马铃薯液体培养基将单孢菌落扩大培养，获得大量的病原菌；利用CTAB法提取薏苡黑穗病病原菌基因组DNA，用黑粉菌属bE交配型基因特异性引物bE4/bE8对其进行扩增，若能扩增出一条长459bp黑穗病菌特异保守序列的目的片段，则证明所分离的病菌为薏苡黑穗病病原菌。该专利公开的鉴定方法是用于已感染黑穗病薏苡植株病原菌的鉴定，并未涉及抗黑穗病植株的分子鉴定方法。

又如申请号为CN201210051544.1的专利公开了利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性方法，包括基因组DNA的提取、SCAR-PCR标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测；采用的检测引物是甘蔗SCAR-F和SCAR-R，其中SCAR-F是5'-CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3'，SCAR-R是5'-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3'。该专利公开的鉴定方法是用于甘蔗抗病性品种的鉴定。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明研究者对薏苡黑穗病瘿中的菌类进行了研究，研究表明：薏苡黑穗病瘿中存在多种真菌菌群，其中，真菌属Sporisorium和Ustilago为优势菌群，在NCBI数据库中查找Sporisorium和Ustilago线粒体全长序列，选择较为保守且常见的基因ATP6设计引物，用设计的引物对田间表现正常、未出现黑穗病的薏苡植株进行检测，确定为真实抗黑穗病薏苡种质。

具体是通过以下技术方案实现的：

一种薏苡抗黑穗病种质的鉴定方法，包括以下步骤：