[发明专利]一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供了一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法，所用引物序列为：F：5’‑GAACTTACCATTGTTGCCTCG‑3’，R：5’‑CGCCGTTGTATTTCAGGAG‑3’；快速检测方法包括以下步骤：提取润楠叶片DNA；以润楠叶片DNA为模板采用上述引物进行巢式PCR反应；检测扩增产物，当PCR产物呈现578bp的扩增条带时，即表明叶片中含有致其叶枯的小孢拟盘多毛孢菌。方法可有效解决传统的诊断方法存在的耗时、耗材和易错过最佳防治时期的问题。

技术领域

本发明属于植物疾病诊断技术领域，具体涉及一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

润楠(Machiluspingii)，樟科润楠属(Machilus)乔木，国家Ⅱ级重点保护野生植物，我国西南地区特有品种，主要分布于四川盆地西缘山地。其树型高大挺直，木材纹理致密，是上等的用材树种，为我国著名的珍贵用材和观赏树种之一，具有重要的经济效益与生态效益。有研究表明，我国82种润楠属植物有71种处于濒危状态，因此当前各级政府大力支持发展润楠等珍稀乡土树种人工林。

由小孢拟盘多毛孢(P.microspore)引起的润楠叶枯病是目前危害润楠的主要病害。受病原菌侵染后，植株出现叶梢枯黄、叶片早落等症状，重者叶片全部脱落、植株枯死。叶枯病对润楠幼苗的栽培带来极大困难，因此快速、准确地在发病初期对病菌的侵染动态进行检测，采取及时有效的防治方法控制病害的发生对于减少经济损失具有十分重要的意义。

传统的林木真菌病害的诊断主要是在病原菌侵染林木并表现出一定的症状之后，通过症状观察、组织分离的方法进行鉴定，但这一方法耗时、耗材且十分被动，易错过最佳防治时期。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法，该方法可有效解决传统的诊断方法存在的耗时、耗材和易错过最佳防治时期的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种快速检测润楠叶枯病的引物，其序列为：F：5’-GAACTTACCATTGTTGCCTCG-3’，R：5’-CGCCGTTGTATTTCAGGAG-3’。

一种快速检测润楠叶枯病的方法，包括以下步骤：

(1)提取润楠叶片DNA；

(2)以润楠叶片DNA为模板，采用上述引物进行巢式PCR反应；

(3)检测扩增产物，当PCR产物呈现578bp的扩增条带时，即表明叶片中含有致其叶枯病的小孢拟盘多毛孢菌。

进一步地，步骤(2)中巢式PCR扩增体系25μL包括：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶22μL。

进一步地，步骤(2)中扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，63℃退火10s，72℃延伸20s，共34个循环，72℃延伸2min。

一种用于快速检测润楠叶枯病的试剂盒，包括：上述引物、润楠叶片DNA提取试剂盒和TaqDNA聚合酶。

采取上述方案所产生的有益效果为：本发明采用特异性的引物以及巢式PCR技术可以有效快速的从健康的润楠叶片中鉴定出早期感病的润楠树，并可以快速获得鉴定结果，以便及时采取防治措施，无需等待犯病症状表达；而且，本法发明的检测方法具有灵敏度高的优点。

附图说明

图1为P.microspore与其他菌DNA经常规PCR扩增后的电泳结果；

图2为常规PCR灵敏度验证电泳结果；

图3为巢式PCR灵敏度验证电泳结果；