[发明专利]一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，属于植物分子生物学领域。该方法包括如下步骤：根据马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因PGA2设计用于基因敲除的gRNA靶点，合成引物gRNA，然后将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒，再将表达盒插入到表达载体PCAMBIA 1300中，将得到的连接物转化到大肠杆菌中，摇菌测序后，构建用于遗传转化的农杆菌工程菌，转化马铃薯，提取基因组DNA，筛选出阳性植株。本发明首次在马铃薯作物中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因进行编辑，为后续基因功能研究或马铃薯基因工程育种等奠定技术基础。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种应用于马铃薯上的 CRISPR/Cas9载体的构建方法。

背景技术

基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术，又称为基因打靶。其技术原理是构建一个人工核酸酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。而CRISPR-Cas9(cluster regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术由于它的简单性和低成本，是目前最受欢迎的基因编辑技术。此技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。在向导RNA(sgRNA) 的带领下，通过碱基互补配对可以靶向PAM(原间隔序列临近基序， protospacer adjacent motif)附近的目标序列，Cas9蛋白是一种双链DNA核酸酶，会对该基因上下游的靶点进行切割，使DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中靶标基因的敲除。这种技术在生物工程等方面具有广阔的应用前景，已经在很多作物中得到应用。

马铃薯具有抗衰老的功效。它含有丰富的维生素B1、B2、B6和泛酸等B 族维生素及大量的优质纤维素，还含有微量元素、氨基酸、蛋白质、脂肪和优质淀粉等营养元素。近年来，随着人们生活水平的提高，对马铃薯的品质要求也越来越高，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术也对提高马铃薯的品质起到了创新性的作用。

发明内容

本发明的目的在于利用一种CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体在马铃薯基因功能方面的研究或马铃薯基因工程育种中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、CRISPR靶点设计：

根据马铃薯PGA2基因序列号AB839753.1设计sgRNA： GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG；

S2、利用同源重组的原理设计引物oligo：

正向序列：5’-AGTCGAAGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAA-3’，

反向序列：5’-ATTTCTAGCTCTAAAACCTTGCACCACGATTTCACACC-3’；

S3、引物gRNA的形成：

将合成的引物oligo分别稀释成10μM，按如下比例混合，进行退火反应后形成引物gRNA；

反应条件：95℃，2min；95℃，20s；60℃，40s；72℃，15s；15cycles； 72℃，5min；