[发明专利]鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及引物

说明书

本发明公开了一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；还提供了鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述引物对、SYBR Premix EX Taq、ROX和RNase Free ddH₂O。本发明采取SYBR GreenⅠ染料法，无需设计探针，可减少成本，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，为鼠棒状杆菌的早期诊断提供依据，能很好地应用于临床病料的检测。该试剂盒使用简单快捷、特异性好、灵敏度高，可将检测周期缩短至2天内。

技术领域

本发明属于分子生物学技术检测领域，具体涉及一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及引物。

背景技术

鼠棒状杆菌，也称“库彻氏棒状杆菌”，是棒状杆菌属的革兰氏阳性杆菌，是一种人畜共患的病原菌。该病原体在多种实验动物宿主中感染，以大鼠和小鼠居多，偶有地鼠和豚鼠感染的报道。鼠棒状杆菌病多呈隐性感染，发病率和死亡率高，严重爆发可导致动物群覆没，因此鼠棒状杆菌是我国实验动物无特定病原体动物(Specific Pathogen Free,SPF)级大鼠与小鼠病原体控制的必检项目。

国家标准GB/T 14926.9-2001中规定实验动物鼠棒状杆菌的检测方法是细菌分离培养，是目前的主要检测方法，但由于该菌培养条件要求严苛，生长缓慢，易漏检。也先后有血清学诊断方法的报道，如微量凝剂试验、间接免疫荧光抗体法(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA) 等，该方法同样存在操作复杂、时间长、灵敏度低、特异性差，容易造成漏检等问题。

实时荧光定量PCR(qPCR)是在常规PCR基础上发展起来的核酸定量技术。它通过加入相应的荧光染料或荧光标记的探针来完成定量功能。该方法指通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该方法特异性强、敏感度高、减少了假阳性现象的出现，且该技术为完全闭管式操作，不仅避免了常规PCR开盖引起的产物污染问题，无需后续的琼脂糖凝胶电泳鉴定，减少了一定程度的环境污染。该技术现已在基础科学研究、转基因产品和食品安全检测、医学诊断、药物研发、海关检验检疫等科研和实践领域得到广泛应用。

目前根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可将实时荧光定量PCR分为两类，第1类为DNA染料法，例如SYBR Green I和Eva Green，对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测；第2类是荧光探针法，将荧光素与寡聚核苷酸相连，对特异性的PCR产物进行检测，荧光探针法又可根据加入PCR反应的荧光分子的类型分为：引物/探针法、探针法(包括水解探针和杂交探针)和核酸类似物法三种。

就DNA染料法而言，目前有多种双链DNA结合染料可用于实时荧光定量PCR，包括EB、SYBR Green Ⅰ、SYBR Gold、EvaGreen等。其中最常用的是SYBR Green Ⅰ，这种DNA 染料吸收蓝光(λmax＝497nm)、发射绿光(λmax＝520nm)，对DNA双链具有高亲和力。当它结合到双链DNA小沟部位时，会发出很强的荧光，在qPCR延伸阶段能够被检测到，具有较强的敏感性，并且不需要因模板不同而进行特别定制，操作简易，相对于荧光探针类来说价格较低，因此被广泛应用。但是在qPCR扩增过程中，非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合产生荧光信号，这种染料与双链DNA结合非特异性的特点会造成假阳性，从而影响定量的准确性，因此其特异性不如探针法。针对这一问题，需要用熔解曲线(melting curve)鉴定扩增产物的特异性。熔解曲线分析是将样品从50℃升高至95℃，并监测这一过程荧光信号的变化。到达DNA变性温度时，染料分解导致荧光信号剧烈下降，非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比特异性产物低，故可以通过熔解曲线进行鉴别。此外，注重实验细节如合理设计引物和设定对照也有助于消除非特异性荧光。