[发明专利]一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法

说明书

一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，具体是，将野生型裂殖壶菌菌株经过ARTP诱变处理，经烯草酮平板培养基定向初筛，磷酸香草醛法和摇瓶发酵培养测定的DHA产量为复筛，筛选后获得高产DHA菌株。本发明涉及到的高产DHA筛选方法具有操作简单，筛选成功率高，能快速获取大量目的菌株等诸多优势。

技术领域

本发明涉及微生物突变体筛选技术领域，尤其涉及用于生产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌突变株的筛选即一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法。

背景技术

ω-3系列多不饱和脂肪酸对人体健康有着十分重要的影响，在食品、医药、饲料和化妆品等领域有广阔的应用前景。二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）作为其中一种，对婴儿大脑和视网膜发育有积极作用，俗称脑黄金。我国早在2000年就已批准DHA作为营养强化剂，可以改变膳食结构，增强人体免疫力，市场潜力巨大，被誉为“21世纪功能性食品的主角”。由于它这些重要的生理功能，加快开发和利用DHA资源已被世界各国生化学家、医药研究者和营养专家等研究的热门方向之一。

裂殖壶菌（Schizochytrium）是一种类真菌类的单细胞异养原生生物，在形态、繁殖等方面与真菌非常相似。大多数裂殖壶菌在浮游植物的残渣上腐生，少数寄生在某些低等的水生生物身上。裂殖壶菌脂质中多不饱和脂肪酸组成简单，菌体本身无危害，易培养，是目前最具前景的工业化生产DHA的微生物。

为了进一步提高裂殖壶菌DHA产量，通过诱变手段获得高产菌株已经被众多科研工作者所研究。目前获得突变体的筛选方法有很多，比如苏丹黑B染色法、低温高糖处理法、流式细胞仪筛选法等，但是这些方法存在筛选效率低、操作复杂的缺点。

发明内容

针对现有技术不足，本发明一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，将野生型裂殖壶菌菌株经过诱变处理，先经烯草酮平板培养基定向初筛，再以磷酸香草醛法和摇瓶发酵培养测定的DHA产量为复筛，快速大量筛选高产DHA菌株，并且具有操作简单，筛选成功率高，能快速获取大量目的菌株等诸多优势。

一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法中培养基（g/L）成分包括以下成分：

固体培养基：葡萄糖10，蛋白胨1.5，酵母膏0.1，琼脂粉20，海盐33，PH自然，1×10⁵ Pa、115 ℃灭菌21 min。发酵培养基：葡萄糖20，蛋白胨1.5，酵母膏1.0，KH₂PO₄ 0.25，海盐33，PH自然，1×10⁵ Pa、115 ℃灭菌21 min。

一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，主要包括以下步骤：

（1）种子液制备：在无菌超净台中，使用接种环挑取新鲜固体培养基中的单菌落，接种在装有40 mL液体培养基的锥形瓶内，在28℃、150 rpm摇床中培养24 -36 h；

（2）菌悬液制备：取5%的上述种子液接种至发酵液体培养基中，在28℃、150 rpm摇床中培养24-36 h，取适量菌液稀释后，调整细胞OD₆₆₀ 值为0.3-0.4之间，用于ARTP诱变处理；

（3）ARTP诱变处理：分别取上述菌悬液10 μL均匀涂布在无菌载片上，将载片放于培养皿中并转移至ARTP诱变仪凹槽内，凹槽下方固定座固定相应的EP管，用于承接载片，EP管内含有1 mL的无菌蒸馏水。ARTP诱变仪功率设定为120 W，气量设定为10 SLM，选择致死率在90%左右的处理时间进行诱变处理；